法洛四联症病儿右心室结构和功能与基质金属蛋白酶的关系
【关键词】 法洛四联症;心肌;胶原;基质金属蛋白酶类
［摘要］目的 探讨法洛四联症（TOF）病儿右心室结构和功能与心肌胶原代谢和基质金属蛋白酶（MMPs）的关系。方法 应用改良BERGMAN法测定23例TOF和18例室间隔缺损（VSD）病儿右心室和右心耳心肌胶原的含量，同时应用RT-PCR技术测定右心室和右心耳心肌组织MMPs mRNA的表达。应用放免法测定血清Ⅲ型胶原氨基末端肽（P-Ⅲ-NP）和Ⅰ型胶原羧基末端肽（P-ⅠCP）的浓度，应用SONOS-5500彩色多普勒超声仪测定TOF病儿右心室内径（RVD）、右心室前壁厚度（RVAW）、右心室舒张早期与舒张晚期峰值血流充盈速度的比值（E/A）。结果 TOF病儿右心室心肌胶原含量、血清P-Ⅲ-NP和P-ⅠCP浓度明显高于VSD组和健康组儿童，右心室心肌组织MMP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA的表达较VSD组明显下调。TOF病儿右心室心肌胶原含量、血清P-Ⅲ-NP和P-ⅠCP浓度与E/A呈负相关，与RVD和RVAW呈正相关;TOF病儿右心室心肌组织MMP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA的表达与E/A、RVD和RVAW呈正相关。结论 TOF病儿右心室结构和功能与心肌胶原代谢和基质金属蛋白酶的表达密切相关。
［关键词］ 法洛四联症;心肌;胶原;基质金属蛋白酶类
［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the relationship between the structure and function of right ventricle and matrix metal-loproteinases （MMPs） in children with tetralogy of FALLOT （TOF）. MethodsThe contents of myocardial collagen of right ventricle and right auricle were measured in 18 children with ventricular septal defect （VSD） and 23 with TOF using modified Bergman's method; and the myocardial MMPs mRNA expression was determined by RT-PCR. The concentrations of P-Ⅲ-NP and P-ⅠCP were detected by radioimmunoassay. The internal diameter of right ventricle （RV）， the thickness of the anterior wall of RV， and the ratio of early and late diastolic blood flow filling velocity of RV （E/A） were measured by SONOS-5500 echocardio-graphy. ResultsThe contents of myocardial collagen of RV and the serum concentration of P-Ⅲ-NP and P-ⅠCP in TOF group were higher than those of VSD group and healthy children group. The myocardial mRNA expression of MMP-1， MMP-2， and MMP-9 of RV in TOF group were lower than those of VSD. The content of cardial collagen of RV and serum P-Ⅲ-NP and P-I CP in TOF were negatively correlated with E/A， but positively correlated with IDRV and thickness of anterior wall of RV. The myo-cardial mRNA expression of MMP-1，MMP-2， and MMP-9 of RV in TOF group were positively related with E/A ， RVD and thick-ness of anterior wall of RV. ConclusionThe structure and function of right ventricle in children with TOF were closely related with the metabolism of cardial collagen and the expression of matrix metalloproteinases.
［KEY WORDS］tetralogy of FALLOT; myocardium; collagen; matrix metalloproteinases
法洛四联症（TOF）病儿术前由于心肌低氧和右心室压力负荷的增加，导致右心室心肌纤维化的发生。心肌纤维化是心脏基质成分合成与降解代谢失平衡的结果，是受损心肌组织僵硬度的结构基础。研究表明，基质金属蛋白酶（MMPs）是维持心肌胶原纤维及心脏结构正常的重要因素，MMPs的表达 失调可导致心肌纤维化的发生［1］。有关TOF病儿右心室心肌纤维化与MMPs关系的研究尚未见报道。本文观察了23例TOF病儿右心室和右心耳心肌胶原的代谢和心肌组织MMPs mRNA的表达以及TOF病儿右心室结构和功能的变化，旨在探讨TOF病儿右心室结构和功能变化与心肌胶原代谢和MMPs表达的关系。
1 资料与方法
1.1 对象
1.1.1健康儿童组（HC组） 选取健康儿童12例，男7例，女5例;年龄1～6岁，平均3.8岁。
1.1.2室间隔缺损组（VSD组） 2002年10月～2003年10月我院收治的18例VSD病儿，男10例，女8例;年龄1～7岁，平均4.2岁。所有病儿肺动脉压力和心功能正常，其诊断均被手术所证实，且近期未用过钙拮抗剂、β受体阻滞剂和血管紧张素转换酶抑制剂。
1.1.3TOF组 为同期我院收治的23例TOF病儿，男12例，女11例;年龄1～10岁，平均4.6岁;平均血氧饱和度为0.71±0.06。病儿的诊断被手术所证实，且近期未用过钙拮抗剂和β受体阻滞剂。
1.2 方法
1.2.1血清和心肌组织胶原指标检测 术前抽取静脉血，采用放免法测定血清Ⅲ型胶原氨基末端肽（P-Ⅲ-NP）和Ⅰ型胶原羧基末端肽（P-ⅠCP）浓度。体外循环前切取右心耳一小块，大小为0.5 cm× 0.4 cm ，术中切取右心室心肌组织一小块，大小为 0.5 cm× 0.4 cm×0.3 cm，-80 ℃冰箱保存。其中一部分右心耳和右心室心肌组织用于MMP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA表达的测定，采用RT-PCR方法［2，3］，以吸光度（ A ）表示。分别称取剩余的右心耳和右心室心肌组织各100 mg，用生理盐水冲洗后剪碎，用6 mol/L盐酸于110 ℃水解24 h，然后70 ℃水浴蒸干，加1 mL蒸馏水复溶、过滤;采用改良的BERGMAN法［4］测定羟脯氨酸浓度，再乘以7.46换算成胶原含量，结果以每克心肌组织含胶原的量（mg）表示。
1.2.2右心室结构和功能的检测 使用SONOS-5500型彩色多普勒超声诊断系统测定右心室结构和舒张功能，其检测指标如下:右心室舒张早期与舒张晚期峰值血流充盈速度的比值（E/A）、室间隔厚度（IVS）、右心室内径（RVD）、右心室前壁厚度（RVAW）和右心室流出道内径（RVOT）。
1.2.3统计方法 建立数据库，应用SPSS 10.0软件包进行分析。组间比较应用方差分析，相关性检验采用直线相关分析。
2 结果
2.1各组血清P-ⅠCP和P-Ⅲ-NP浓度的比较 HC组和VSD组间血清P-ⅠCP和P-Ⅲ-NP浓度无显著差别（ F=3.46，4.28，q=1.02、1.25，P >0.05 ），但TOF组病儿血清P-ⅠCP和P-Ⅲ-NP浓度明显高于HC组和VSD组（ q=4.67～7.17， P < 0.01 ）。见表1。
2.2 VSD组、TOF组病儿心肌胶原含量和MMPs mRNA比较 VSD组和TOF组右心耳心肌胶原含量无明显差别（ P >0.05），但TOF组病儿右心室心肌胶原含量明显高于VSD组（ P <0.01）。VSD组和TOF组右心耳心肌MMP-1和MMP-2 mRNA的表达无显著差别（ P >0.05），但TOF组右心耳心肌MMP-9 mRNA的表达较VSD组病儿减少（ P <0.05）。TOF组病儿右心室心肌MMP-1、MMP-2和MMP-9的 mRNA表达均较VSD组明显下调（ P <0.01）。见表2。
2.3 三组右心室结构和舒张功能测定结果比较 VSD组病儿右心室E/A、IVS、RVD、RVAW和RVOT与HC组比较无显著差别（ F=3.338～ 4.784 ，q=0.891～1.114，P >0.05），但TOF组病儿E/A、RVOT明显低于HC组和VSD组（ q= 4.778～ 5.635 ，P <0.01），而IVS和RVAW明显高于HC组和VSD组（ q=5.837～6.718，P <0.01）。见表3。
表1 三组血清P-ⅠCP、P-Ⅲ-NP浓度比较（略）
表2 VSD组和TOF组心肌胶原含量及MMPs mRNA比较（略）
与TOF组比较，*t=2.226～10.230，P<0.05、0.01
表3 三组右心室结构和舒张功能测定结果（略）
2.4 VSD组和TOF组病儿右心室结构和舒张功能与MMPs等指标的关系 TOF病儿血清P-ⅠCP和P-Ⅲ-NP浓度与右心室E/A呈负相关（ r=-0.554、-0.513，P < 0.01 ），与RVD和RVAW呈正相关（ r=0.416～ 0.498 ，P <0.05）;TOF病儿右心室心肌MMP-1和MMP-9的mRNA表达与其右心室E/A、RVD、RVAW和RVOT均呈正相关（ r=0.411～0.484， P < 0.05），MMP-2 mRNA表达与右心室E/A、RVD、RVAW呈正相关（ r=0.427～0.501，P < 0.05 ），与RVOT无相关性（ r=0.391，P >0.05）;TOF病儿右心室胶原含量与右心室的E/A呈负相关（ r=-0.612，P <0.01），与IVS、RVD、RVAW和RVOT呈正相关（ r=0.477～0.495，P <0.05）。VSD病儿仅右心室心肌胶原含量与右心室E/A呈负相关（ r=-0.467，P <0.05）。
3 讨论
心肌纤维化是指心肌胶原浓度或胶原容积分数的显著升高，分为修复性纤维化和反应性纤维化。前者常见于心肌缺血和扩张性心肌病，由于胶原网络破坏和连接网索破裂而导致胶原重构;后者常见于心脏长期压力负荷过度的情况下，导致心肌肥大及胶原含量的过度增加［5］。TOF病儿由于存在慢性低氧和严重的右心室压力负荷过度，导致心肌纤维化的发生，其类型可能为混合性的。本文结果亦显示，TOF病儿右心室心肌胶原的含量明显增加，同时反映心肌纤维化程度的血清P-Ⅲ-NP和P-ⅠCP浓度亦明显增加，表明TOF病儿右心室心肌胶原代谢异常，提示右心室心肌纤维化的发生。已证实MMPs的表达失调是导致心肌纤维化的重要原因。SIVASUBRAMANIAN等［6］采用转基因大鼠，使其心脏因过度表达肿瘤坏死因子而导致心肌重构及心室扩大，来研究不同时期内MMPs活性与心肌纤维化、心室重构及心室扩大的关系，结果显示，8～12周后心肌纤维胶原含量增加，MMPs活性下降;此外，还观察到在心肌纤维胶原含量增加的同时并未发现心室进一步扩大;提示MMPs是导致心室重构、心肌纤维化的直接原因。本文结果亦显示，TOF病儿在右心室心肌胶原含量明显增加的同时，心肌组织MMP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA的表达也呈明显下调，提示TOF病儿右心室心肌MMPs表达失调。心肌组织中的MMPs主要由成纤维细胞产生，MMP-1的主要水解底物是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原纤维，而MMP-2和MMP-9主要水解变性胶 原及基膜的主要成分Ⅳ型胶原。因此，MMPs表达减少将导致心肌胶原分解减少，心肌内胶原堆积，从而导致心肌纤维化。MMPs的表达和活性受转录（酶原合成）、酶原激活及其抑制剂3个水平的调控。近年研究表明，机械应力和室壁张力对MMPs也具有调节作用，对心脏成纤维细胞的机械牵拉和室壁张力的增加早期可使MMP-2和MMP-9的基因表达增强，但晚期其表达则明显下降［7］。由于TOF病儿右心室压力负荷明显增加，导致心室壁张力亦明显增加，势必影响MMP-2和MMP-9的表达。本文结果印证了上述结论。心肌纤维化将导致心室的结构和功能的变化，使舒张功能发生障碍，心室几何构型发生改变。本文结果表明，TOF病儿右心室舒张功能和几何构型异常;同时，TOF病儿右心室胶原含量、血清P-ⅠCP和P-Ⅲ-NP浓度与右心室E/A比值呈负相关，与RVD和RVAW呈正相关;TOF病儿右心室心肌组织MMP-1、MMP-2和MMP-9的 mRNA表达与右心室E/A、RVD、RVAW均呈正相关，MMP-1和MMP-9的 mRNA表达还与RVOT呈正相关;提示右心室心肌的胶原代谢和MMPs的表达与右心室结构和功能密切相关。
［参考文献］
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［6］ SIVASUBRAMANIAN N， COKER M L， KURRELMEYER K M， et al. Left ventricular remodeling in transgenic mice with cardiac restricted overexpression of tumor necrosis factor［J］. Circulation， 2001，104（7）:826-833.
［7］ CHESLER N C， KU D N， GALIS Z S. Transmural pressure induces matrix-degrading activity in porcine arteries ex vivo［J］. Am J Physiol， 1999，277:H2002-2009.
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