淋巴管标记方法及标志物的探讨

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淋巴管标记方法及标志物的探讨

【摘要】目的探讨不同标记方法及标志物在淋巴管检测中的价值，为研究肿瘤淋巴管的生成提供理想实验方法。方法用5′?核苷酸酶（5′?Nase）酶组织化学法对30例正常胃肠新鲜标本（胃及肠组织标本各15例）进行染色观察；用免疫组织化学PV9000法对30例相应胃肠标本石蜡包埋组织行血管内皮生长因子受体?3（VEGFR?3）和肾小球足突细胞膜黏蛋白（Podoplanin）染色观察。结果淋巴管密度（LVD）:5′?Nase组LVD为6.78±1.16，Podoplanin组为6.85±0.84，VEGFR?3组为14.33±2.24。VEGFR?3组LVD明显高于5′?Nase组及Podoplanin组，差异均有显著性（t＝7.55、7.49，P<0.01），Podoplanin组与5′?Nase组比较差异无显著性（t＝0.07，P>0.05）。形态学观察：5′?Nase及Podoplanin标记的阳性淋巴管位于黏膜固有层及黏膜下层，管壁较薄，管腔内无红细胞；VEGFR?3染色阳性的淋巴管较多，位于黏膜固有层及黏膜下层，部分管壁较厚，管腔内见红细胞，且黏膜肌也呈阳性。染色背景：Podoplanin和VEGFR?3免疫组织化学染色背景清晰，能清楚显示阳性淋巴管与周围组织结构的关系；5′?Nase染色背景呈淡黄色，无法观察淋巴管周围的组织结构。结论免疫组织化学技术下Podoplanin染色可以作为标记淋巴管的理想实验方法。Podoplanin是一种比较特异性的淋巴管标志物。

【关键词】淋巴 5 核苷酸酶血管内皮生长因子受体?3 肾小球足突细胞膜黏蛋白酶组织化学免疫组织化学
［ABSTRACT］ObjectiveTo compare different lymphatic vessel markers and labelling methods in order to find an ideal way for studying lymphangiogenesis in tumors. MethodsThirty normal gastrointestinal tissues were stained with 5′?Nase. The expression of VEGFR?3 and Podoplanin in 30 paraffin?embedded samples were examined using immunohistochemistry technique. ResultsLymphatic vessel density (LVD) was different with different staining methods: The LVD of VEGFR?3 group (14.33±2.24) was significantly higher than that of 5′?Nase group (6.78±1.16) and podoplanin group (6.85±0.84) (t＝7.55，7.49；P<0.01). There was no significant difference between 5′?Nase and podoplanin groups （t＝0.07，P>0.05）. Lymphatics positively stained by 5′?Nase and podoplanin were found in lamina propria and submucosa. The lymphatic walls were thinner and no red blood cells were found within lymphatics. VEGFR?3 positively stained lymphatics were also found in lamina propria and submucosa. Part of the lymphatic walls were thicker, and red blood cells were found in the lymphtic duct. There was a clear background after podoplanin and VEGFR?3 staining, which clearly showed the relationship between the lymphatics and the surrounding tissue, while 5′?Nase staining showed wheat color background, which obscured the surrounding tissue structure of the lymphatics. Conclusion Immunohistochemistry staining with podoplanin was an ideal method for labeling tissue lymphatics.

［KEY WORDS］lymphatics; 5′?Nase; VEGFR?3; podoplanin; enzyme histochemistry; immunohistochemistry

标记组织中淋巴管常用的方法有免疫组织化学染色检测血管内皮生长因子受体?3（VEGFR?3）、肾小球足突细胞黏蛋白（Podoplanin）和淋巴管内皮透明质酸受体?1（LYVE?1）等的表达，以及酶组织化学标记5′?核苷酸酶（5′?Nase)。但文献中采用不同检测方法和不同标记物检测同类组织中的淋巴管数量有明显差别，其研究结论也不一致［1,2］。因此，本研究分别应用酶组织化学及免疫组织化学方法检测30例正常胃肠黏膜及黏膜下层的淋巴管中5′?Nase、VEGFR?3和Podoplanin的表达，旨在寻找一种标记淋巴管的理想方法和比较特异性的标志物。

1 材料与方法

1．1 材料来源

收集青岛大学医学院附属医院2005年9～12月手术切除的新鲜胃癌及结直肠癌标本中癌周正常的胃肠组织共30例（胃及肠组织标本各15例），所有标本均放入－70 ℃液氮中保存。

1．2 试剂来源

兔抗人VEGFR?3抗体（工作液）、PV9000通用型试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。鼠抗人Podoplanin单克隆抗体（稀释度为1∶150）购自美国Angiobio公司。酶组织化学试剂：多聚甲醛（上海化学试剂公司），三羟甲基氨基甲烷（Ttis，上海试剂三厂），顺丁烯二酸（上海试剂三厂），腺苷5′?磷酸钠（Sigma公司），硫酸镁（汕头光华化学试剂公司），硝酸铅（中国金山化工厂），硫化胺（汕头光华化学试剂公司）。

1．3 实验方法

1．3．1 酶组织化学法 5 μm厚正常胃肠组织冷冻切片，用50 g/L多聚甲醛固定45 min。蒸馏水冲洗2 min，共3次。置于新鲜配置的孵育液(1.25 g/L腺苷5′?磷酸钠20 mL，0.2 mol/L Tris?马来酸缓冲液22 mL，20 g/L硝酸铅3 mL，0.1 mol/L硫酸镁5 mL)中37 ℃孵育15 min。40 g/L甲醛盐水作用30 min。蒸馏水冲洗2 min，共3次。5～10 g/L硫化胺作用2 min。蒸馏水冲洗2 min，共3次。甘油明胶封固。

1．3．2 免疫组织化学PV 9000法染色将冷冻切片剩余的对应胃肠组织经100 g/L中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，行免疫组织化学PV 9000法染色。具体步骤按说明书操作。分别用PBS代替2种一抗作阴性对照，用已知阳性组织切片作阳性对照。

1．4 结果判断

1．4．1 5′?Nase淋巴管染色结果判断标准以淋巴管内皮细胞的胞质膜呈现棕黄色至棕黑色沉淀为5′?Nase染色阳性。

1．4．2 Podoplanin及VEGFR?3染色结果判断标准以正常胃肠黏膜及黏膜下淋巴管内皮细胞的胞质内出现棕黄色颗粒为Podoplanin及VEGFR?3染色阳性判定标准。

1．4．3 淋巴管密度（LVD）的定量测定先在低倍镜下观察染色阳性的淋巴管，确定淋巴管密度最高处，单个内皮细胞着色亦作为一个计数单位，不以是否形成管腔和管腔内有无淋巴细胞作为计数标准；然后在400倍视野下选择5个不重复的视野计数，计算每例正常胃肠标本的单位视野（400倍）平均淋巴管数，即间质LVD，单位为个。

1．5 统计学处理

采用t检验，所有数据统计均在SPSS软件上进行。

2 结果

2．1 5′?Nase、Podoplanin和VEGFR?3在正常胃肠组织中的表达

2．1．1 形态学观察 5′?Nase及Podoplanin染色阳性的淋巴管位于黏膜固有层及黏膜下层，大部分有腔或管腔不完整，少数呈不规则条索状，淋巴管管壁较薄，管腔较大，有些可见一端管腔呈开放状，管腔内无红细胞（图1、2）。VEGFR?3染色阳性的淋巴管较多，位于黏膜固有层及黏膜下层，部分管壁较厚，管腔内见红细胞，且黏膜肌也呈阳性（图3）。

2．1．2 染色背景 Podoplanin和VEGFR?3免疫组织化学染色背景清晰，能清楚显示阳性淋巴管与周围组织结构的关系；5′?Nase染色背景呈淡黄色，无法观察淋巴管周围的组织结构。

2．2 正常胃肠组织中3种染色标记LVD的比较

5′?Nase组在胃肠组织中LVD为6.78±1.16，Podoplanin组LVD为6.85±0.84，VEGFR?3组LVD为 14.33±2.24。VEGFR?3组LVD明显高于5′?Nase组及Podoplanin组，差异均有极显著意义（t＝7.55、7.49,P<0.01）；Podoplanin组与5′?Nase组比较，差异无显著性（t＝0.07，P>0.05）。

3 讨论

淋巴管识别及淋巴管内皮细胞标记是研究肿瘤淋巴管生成的基本方法之一。目前，酶组织化学5′?Nase染色法和免疫组织化学染色法是较成熟的淋巴管识别和鉴别淋巴管内皮细胞的方法。

3．1 5′?Nase染色法在淋巴管标记中的应用

5′?Nase存在于淋巴管内皮细胞的胞质膜上，在血管内皮细胞上几乎不表达。5′?Nase染色是以腺苷5′?磷酸钠为底物，用镁离子作激活剂，铅离子作捕获剂，使生成磷酸铅，再入硫化胺显色，使富有5′?Nase的淋巴管壁生成棕色的硫化铅沉淀［3～5］。许多研究采用5′?Nase染色标记淋巴管，研究肿瘤淋巴管生成的意义［2，6］。但是酶组织化学染色法，尤其5′?Nase染色很容易受实验条件的影响，其中某一环节的改变都会对结果产生很大的影响。由于对酶组织化学染色的影响因素很多及各种酶之间交叉反应的存在，虽然经反复实验摸索出了最佳反应条件，但非特异性染色仍很难避免，而且背景较深，影响其结果的观察和判定。这些因素均导致酶组织化学法在淋巴管染色中的应用受到一定的限制。本研究染色结果显示，5′?Nase染色标记的30例正常胃肠组织中的阳性淋巴管位于黏膜固有层及黏膜下层，其LVD为6.78±1.16，与Podoplanin组比较，没有明显差异。大部分有腔或管腔不完整，少数呈不规则条索状，淋巴管壁较薄，管腔较大，管腔内无红细胞。但该染色法背景较深，呈淡黄色，并且无法观察淋巴管周围的组织结构。结果提示，5′?Nase染色法可为形态学上研究淋巴管提供较可靠的实验方法，但非特异性染色难以避免，背景较深，影响结果的观察和判定。

3．2 VEGFR?3和Podoplanin在淋巴管内皮细胞标记中的应用

目前，免疫组织化学染色法被认为是鉴别淋巴管内皮细胞与血管内皮细胞的最佳方法。VEGFR?3是一种酪氨酸激酶受体，是目前应用最多的淋巴管内皮细胞标记物，其配体VEGF?C和VEGF?D是淋巴管内皮生长的重要调节因子。但在某些病理状态下，VEGFR?3能够被重新激活而发挥促血管生成活性［8］。有研究结果显示，VEGFR?3在肿瘤血管内皮细胞有表达，使用抗VEGFR?3抗体不能很好区分血管和淋巴管，故VEGFR?3并不被认为是淋巴管的特异性标志物。本研究结果显示，应用免疫组织化学VEGFR?3染色法，30例正常胃肠组织尽管背景清晰，能清楚显示阳性淋巴管与周围组织结构的关系，但阳性表达的“淋巴管”较多，LVD为14.33±2.24，明显高于5′?Nase组及Podoplanin组。部分管壁较厚，腔内见红细胞，管壁平滑肌和黏膜肌也呈阳性表达。因此，我们认为部分VEGFR?3阳性染色的“淋巴管”实际是血管，VEGFR?3不能作为淋巴管内皮细胞的特异性标记物。

Podoplanin是一种存在于肾小球上皮细胞上的膜蛋白［9］，仅出现在小淋巴管，在含有平滑肌细胞的较大淋巴管内并不出现，在淋巴结内高度内皮化的小静脉上这种蛋白也为阴性。CURSIEFEN等［10］采用免疫金标记技术及免疫电镜技术研究了角膜的淋巴管生成，发现表达Podoplanin的内皮细胞具有淋巴管内皮细胞的超微结构特点。因而，Podoplanin可以作为淋巴管内皮细胞的特异性标志物。本研究通过免疫组织化学PV 9000法检测30例正常胃肠组织中Podoplanin的染色情况，显示Podoplanin阳性着色的淋巴管位于黏膜固有层及黏膜下层，LVD为6.78±1.16，与5′?Nase组比较无显著性差别。大部分有腔或管腔不完整，少数呈不规则条索状，淋巴管壁较薄，部分管腔较大，管腔内无红细胞。该染色法背景清晰，能清楚显示阳性淋巴管与周围组织结构的形态学关系。本文结果说明免疫组织化学技术检测Podoplanin的染色情况可以作为标记淋巴管的理想实验方法，Podoplanin是一种比较特异性的淋巴管标志物，可用于肿瘤淋巴管生成的研究。

【参考文献】
［1］牟江洪，阎晓初，李增鹏，等. 结直肠癌淋巴管生成的特点及其临床病理意义［J］. 中华病理学杂志， 2005，6：348?352.

［2］李中信，贾漪涛，崔宏伟，等. 大肠癌VEGF?CFlt?4表达在淋巴管生成及淋巴结转移中的意义［J］. 中国肿瘤临床， 2004，6：319?321.

［3］廖新波，唐慰萍，赵颖海，等. 5′核苷酸酶碱性磷酸酶双重染色法在毛细淋巴管研究中的应用［J］. 解剖学杂志， 1994，17：405?407.

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［5］王秀琴，瓦龙美，张华，等. 组织化学与免疫组织化学［M］. 北京：首都医科大学出版社， 2002:71?73,77?79.

［6］谢志坚，杨晓峰，范俊，等. 口腔鳞癌癌周淋巴管生成与颈淋巴结微转移［J］. 中华口腔医学杂志， 2004，3：221?223.

［7］DUMONT D J, JUSSILA L, TAIPALE, et al. Cardiovascular failure in mouse embros deficient in VEGF receptor 3 ［J］. Science, 1998,282(5390):946?949.

［8］PARTANEN T A, AROLA J, SAARISTO A, et al. VEGF?C and VEGF?D expression in neuroendocrine cells and their receptor,VEGFR?3, in fenestrated blood vessels in human tissues［J］. FASEB J, 2000,14(13):2087?2096.

［9］MATSUI K, BREITENDER GELEFF S, SOLEIMAN A, et al. Podoplanin, a novel 43kDA membrane protein,control the shape of podocytes［J］. Nephro Dial Transplant, 1999,14(Suppl 1):9?11.

［10］CURSIEFEN C, SCHLOTZER SCHREHARDT U, KUCHLE M, et al. Lymphatic vessels in vascularized human corneas: immunohistochemical investigation using LYVE?1 and podoplanin ［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002,43(7):2127?2135.

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