布氏镜检查丁酸钠影响HT
作者：刘成霞 张尚忠 刘宗印 黄丽华 张孝卫
【关键词】 多功能透射显微镜(布氏镜)；丁酸钠；HT
【摘要】 目的 观察丁酸钠对结肠癌HT２９细胞形态和生物学特性的影响。方法 多功能透射显微镜(布氏镜)动态观察丁酸钠作用前后HT２９细胞的生长状态、细胞运动及贴壁过程的变化。结果 丁酸钠5 mmol/L作用24 h后，HT２９细胞数量明显减少，细胞巢变小，巢内细胞数减少；细胞变成圆形 ，细胞大小趋于一致；细胞核内染色质呈块状聚集，折光性降低，呈现出凋亡细胞形态；贴壁过程明显变缓。结论 丁酸钠可以改变HT２９的生长状态，抑制其生长；布氏镜可以动态地观察药物作用前后培养细胞的形态、微细结构及运动的变化，是一项先进的、具有实用价值的检查技术。
【关键词】 多功能透射显微镜(布氏镜)；丁酸钠；HT２９细胞株
【Ａbstract】 Ｏbjective To investigate the effect of sodium butyrate on the appearance and bionomics of colon cancer line HT２９．Ｍethods Viewing the effect of sodium butyrate on differences of the growth,as well as the cell movement,and the adherence procedure of HT２９ with bradford variable projective microscopy (BVPM).Ｒesults Ａfter 24 hours of coincubation of HT２９ and sodium butyrate (5mmol/L),it was showed that the amount of HT２９ decreased,the cell nests shrank,and the cell population of each cell nest diminished;most of the HT29 changed into globular,and the bulk of HT２９ looked welldistibuted;chromatin gathered uneven,and the refraction weaken,many of them looked as apoptosis cells;adherence procedure of HT２９ stepped down obviously.Ｃonclusion Sodium butyrate may inhibit HT２９ growth and monitoring the changes of cultured cells in cytomorph，fine structure and its movement consecutively with BVPM is an advanced and practical examination technique.
【Ｋey words】 braford variable projective microscopy (BVPM), sodium butyrate,ＨＴ２９ cell line
对肿瘤细胞进行体外培养，同时给予药物干预是目前研究和筛选抗肿瘤药物的主要方法之一。但关于药物对培养的活体肿瘤细胞形态、结构的动态变化研究尚未见报道。本研究应用布氏镜对丁酸钠作用前后HT２９细胞形态和微细结构的变化进行动态图像扫描与分析，清晰地观察到HT２９细胞形态学和生物学行为的动态变化和丁酸钠对肿瘤细胞的影响。
1 材料和方法
1．１ 布氏镜(bradford variable projective microscopy,BVPM,可变投射显微镜的简称)BVPM１５型，美国生物公司生产。
１．２ 细胞株 结肠癌HT２９细胞株，购自山东省医学科学院。
１．３ 药物和标本制备
1．３．１ 丁酸钠(Sodium Butyrate):购于Sigma公司，用PBS配制成01 mol/L的储存液，4 ℃保存备用。临用前用培养液稀释成实验所需浓度。
132 细胞培养方法和标本制备：将15 mm×15 mm大小的盖玻片经常规泡酸、清洗、高压消毒处理后备用。结肠癌HT２９细胞培养于含10%小牛血清(杭州四季青生物制品公司)的RPMI1640(Hyclone),在37℃、5%的CO２、饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期的细胞，用025%的胰蛋白酶消化，用含10%小牛血清的RPMI1640培养液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×１０４／ml。将细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中，每孔接种6 ml。置37 ℃、5%CO２恒温培养箱中培养3 d，待细胞接近长成单层，更换培养液，加入丁酸钠，使终浓度为5 mmol/L，对照组加入等量的PBS。经丁酸钠作用24 h后，终止培养。取出盖玻片，布氏镜观察。
2 结果
2．１ 丁酸钠对HT２９细胞生长状态的影响 常规培养24 h观察，处于对数生长期的HT２９细胞呈巢状生长，巢内细胞密集，细胞间连接紧密，细胞界限不清。细胞巢较大，多见80～１００个细胞组成的大细胞巢。巢内细胞呈梭形或长圆形，细胞大小悬殊，可见处于不同分裂期的细胞及双核、多核细胞，细胞表现出活跃的生物学状态。丁酸钠5 mmol/L作用24 h后观察，细胞明显减少，细胞巢变小，巢内细胞数多在20～４０，巢内细胞松散，单个细胞界限清楚。视野内几乎见不到梭形细胞，细胞变成圆形，细胞大小趋于一致。
２．２ 丁酸钠对HT２９细胞形态的影响 正常培养24 h观察，处于对数生长期的HT２９细胞核大，核浆比例可达1∶１，部分细胞表现为核浆比例倒置。细胞核形状、大小不一，核仁清晰，核内染色质丰富，积聚于核膜周围。丁酸钠5 mmol/L作用24 h后观察，细胞核内染色质呈块状聚集，折光性降低，呈现出凋亡细胞形态。正常培养的HT２９细胞膜表现为明显的不规则性，细胞呈不定形。每个细胞可见20～３０个胞质突起，呈指状、球状或不规则形，可见伪足的形成及迅速变形，形态多样、多变。丁酸钠5 mmol/L作用24 h后动态观察，每个细胞可见3~５个球状突起，变化缓慢。
２．３ 丁酸钠对HT２９细胞贴壁运动的影响 取经胰酶消化的正常HT２９单细胞悬液，滴于载玻片上，再加盖玻片后立即观察。肿瘤细胞在贴壁生长的过程中胞浆丰富，呈流动性，细胞原生质伸展和收缩，使细胞伸出伪足，细胞变形，以阿米巴样运动完成贴壁过后继续生长。布氏镜6000倍间隔1 min连续记录下的HT２９细胞的贴壁过程，可见细胞贴壁迅速。丁酸钠5 mmol/L作用24 h后，观察HT２９细胞的胞浆流动性减慢，伪足、突起较少，贴壁过程明显变缓。
肿瘤细胞的生物学特性与肿瘤细胞的运动密切相关。细胞的运动，首先是伸出胞质突，胞浆随之进入胞质突，形成阿米巴样运动。在体内，当肿瘤细胞脱离原发灶后，必须借助本身的阿米巴样运动侵入细胞外基质，进而侵入继发部位形成转移瘤，完成体内侵袭和转移的过程。体内肿瘤细胞的侵袭和转移与肿瘤细胞的运动性增强有关［１］。而体外培养细胞的运动则表现在细胞贴壁和生长过程中，细胞膜的迅速变化，细胞浆的快速流动预示着细胞的生长代谢活跃。
丁酸钠是一种组蛋白去乙酰基酶抑制剂，它通过抑制组蛋白去乙酰基酶的活性，诱导肿瘤抑制基因的转录，促进细胞分化，抑制肿瘤细胞的生长。由于其具有毒性小、抗肿瘤作用好的特点，近年来被广泛用于白血病、胃癌、大肠癌、前列腺癌、乳腺癌和头颈部肿瘤的研究［２~５］。本研究发现，丁酸钠可以抑制HT29细胞的运输能力，减弱其胞浆流动，从而抑制HT29的贴壁过程，丁酸钠作用后，HT２９细胞形态变圆，细胞膜突起变少，细胞异型性减轻，细胞分裂减慢，明显影响细胞的生长状态。另外，由于用药前细胞分裂活跃，处于分裂期的大细胞较多，细胞大小悬殊，导致细胞平均体积较大。丁酸钠作用后，细胞大小趋于一致，细胞平均体积较用药前减少约1／３，与李春蕊等［6］研究结果一致。考虑可能与丁酸钠诱导p21WAF1等细胞周期调控基因的表达有关。但李丰等［7］在普通光镜下观察了丁酸钠对低分化人结肠癌Clone2A细胞形态的影响，发现经2 mmol/L丁酸钠处理4 d后，细胞变长，并伸出较长的突起，趋向于成纤维细胞形态变化。为何不同细胞对丁酸钠表现不同的反应，机制不清，推测不同细胞株对药物的敏感性不同，也可能与丁酸钠的浓度和作用时间有关。
观察药物作用前后肿瘤细胞的变化是体外评价药物抗癌效果的重要指标。普通光学显微镜只能观察固定在载玻片上的细胞，不能进行动态观察；倒置显微镜尽管可以观察到培养细胞的生长状态，但因其放大倍数有限(一般放大倍数为40～４００倍)，不能清楚的观察活细胞的微细结构和细胞的运动状态。电子显微镜在观察细胞的超微结构方面具有其他显微镜无可比拟的优势，但不能对活细胞进行观察，且标本制作费时、复杂。布氏镜具有40～１６ ００0倍的连续调节功能，同时具备相差、暗视野、微分干涉分析、中密度及偏振光等多种功能，应用布氏镜对体外培养的细胞进行动态图像扫描，能清晰、直观地观察到活细胞的微细结构和动态变化。通过丁酸钠作用前后HT29细胞的变化，可以更直观地观察丁酸钠对HT２９细胞生物学行为的影响。检查只需将细胞培养在盖玻片上，或将细胞悬液直接滴于载玻片上直接观察，无需固定、染色等处理，方法简便，图像直观。
本研究发现，HT２９呈巢状生长，细胞分裂旺盛、运动增强、贴壁过程迅速，呈现十分活跃的生物学特性；丁酸钠可以改变HT２９的生长状态，抑制其生长；布氏镜可以动态地观察药物作用前后细胞形态、微细结构及运动的变化，是一项先进的、具有实用价值的检查技术。
参考文献
１． 陈意生，史景泉．肿瘤分子细胞生物学［Ｍ］．北京：人民军医出版社，2002３１
２． Ｇillenwater A,Zou CP,Zhong M，et al.Effects of sodium butyrate on growth,differentiation,and apoptosis in head and neck squamous carcinoma cell lines［Ｊ］．Ｈead Neck,2000,22(3):247
３． Ｗeidle U,Grossmann A.Inhibition of histone deacetylases:a new strategy to target epigenetic modifications for anticancer treatment［Ｊ］．Ａnticancer Res,2000,20(3A):1471
４． Ｌitvak DA,Hwang KO,Evers BM,et al.Induction of apoptosis in human gastric cancer by sodium butyrate［Ｊ］．Ａnticancer Res,2000,20(2A):779
５． Ｉnoue H,Shiraki K,Ohmori S,et al.Histone deacetylase inhibitors sensitize human colonic adenocarcinoma cell lines to TNF2 related apoptosis inducing ligand 2 mediated apoptosis［Ｊ］．Int J Mol Med,2002,9(5):521
６． 李春蕊，刘文励，周剑锋，等．丁酸钠和曲古抑菌素A促进K562细胞分化机制的研究及其对比［Ｊ］．中国药理学报，２００４，２０（１）：４１
７． 李丰，吴一迪，王芸庆，等．丁酸钠诱导的人大肠癌细胞成熟分化中的表型变化［Ｊ］．中国医科大学学报，２０００，29（6）∶４０４
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