HPLC法测定镇咳宁颗粒中白花前胡甲素的含量
作者：汪保国 陈思东 周卫平 原素 林雪颖【摘要】目的 建立复方制剂镇咳宁颗粒中白花前胡甲素的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法采用phenomenexluna C18色谱柱，乙腈－水梯度洗脱；检测波长：321nm；柱温：26℃。结果 白花前胡甲素在0.185ug～3.7ug范围内线性关系良好，r＝1；回收率99.62％，RSD为0.37％。结论 本测定方法简便可行、重复性好，可用于本制剂中的质量控制。
【关键词】镇咳宁颗粒 白花前胡甲素 含量测定
镇咳宁颗粒由前胡、紫菀、枳壳等多味中药组成，具散风清热，化痰止咳之功。用于治疗风热咳嗽，痰多，喘满等症状。前胡为方中君药，具有散风清热、降气化痰等功效，其主要含有多种类型的香豆素及其糖苷[1]，文献报道白花前胡甲素是前胡药材的代表性成分[2－4]。本方参照药典［5］选用白花前胡甲素作为指标成分，采用HPLC法测定白花前胡甲素的含量。
1 仪器与试药
Aiglent 1100高效液相色谱仪(美国Aiglent公司，配有自动进样器，柱温箱，二级管陈列检测器（DAD），四元（型号）泵，Aiglent-Chemstation 化学工作站。
镇咳宁颗粒(批号：20080115、20080116、20080117)，由广州中医药大学新药开发研究中心提供；阴性对照样品(自制) ；白花前胡甲素(供含量测定用，110753-200413)，由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，液相用水为超纯水，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
phenomenex luna C18(250mm×4.6mm,5um)为固定相；流动相乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表进行梯度洗脱(表1)；流速：1mL／min；检测波长为321nm；柱温：26℃；进样量：10uL。在该色谱条件下，白花前胡甲素峰可达基线分离，其它药材成分对测定无干扰，结果见图1。
表1 流动相梯度洗脱时间表
白花前胡甲素对照品 复方供试品 缺前胡阴性对照
图1 HPLC 色谱图
2.2 对照品溶液的制备
精密称取白花前胡甲素对照品适量，加甲醇溶解定容，制成浓度为0.185mg/mL的白花前胡甲素对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取样品适量，研细，取细粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中,精密加入80%乙醇50ml,称定重量,超声处理（250W，40kHz）30分钟, 放冷，再称定重量,用80%乙醇补足减失的重量,摇匀,微孔滤膜滤过, 取续滤液，作为供试品溶液。
2.4 线性关系考察
分别精密吸取对照品溶液1,2,4，8,l0,l2,16,20uL进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样质量(X，ug)对峰面积(Y，mAu．Sec)进行线性回归，求得回归方程为：Y=1095.7X-1.4585，r=1，线性范围0.185ug～3.7ug。（见表2）
表2 白花前胡甲素标准曲线的测定
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液10uL，连续进样6次，测得峰面积积分值。白花前胡甲素平均峰面积为2031.53，RSD为1.28％。结果表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10uL，于0，2，4，8，12 h进样测定。白花前胡甲素平均峰面积为1052.07，RSD为2.15％。表明供试品溶液在12h内稳定。 2.7 重复性试验
取同一批次样品(20080115)，按供试品溶液制备项下操作，平行制备6份，按上述色谱条件测定含量，结果白花前胡甲素平均含量为0.8012mg/ g，RSD为1.57%。结果表明本方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验
同一批次已知含量的镇咳宁颗粒(20080115)适量，研细，取细粉约0.5g，精密称定，精密加入一定量的白花前胡甲素对照品，按供试品溶液制备项下操作，重复操作6份，按上述色谱条件测定含量，计算回收率，结果见表3。结果表明该方法具有良好的回收率。
表3 加样回收试验结果（n＝6）
2.9 样品测定
精密称取镇咳宁颗粒0.5g，按样品制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪中，测定含量。共测定3批，结果见表4。
表4 镇咳宁颗粒含量测定结果（n＝3）
3 讨论
3.1 供试品溶液制备方法曾考察提取方法(超声、回流)、提取溶剂（50％乙醇、80％乙醇、甲醇）、提取溶媒量(50倍量、100倍量、200倍量) 、提取时间(15min、30min、45 min)。加热回流与超声处理样品，两者提取的白花前胡甲素含量相差不大，从操作简便角度考虑，确定提取方法为超声提取；三种不同溶媒进行提取，白花前胡甲素含量无差异。80%乙醇提取液更为澄清，容易滤过，因此提取溶媒选用80%乙醇；溶媒用量为100倍量和200倍量时提取效果差异不大，均高于50倍量时的提取效果，因此选择溶媒用量为100倍量。超声处理30min与45min结果近似，略高于超声处理15min，因此选择样品超声处理30min。
3.2 本实验曾采用乙腈-水、甲醇-水等系统的不同梯度作为流动相，结果采用乙腈与水溶液梯度洗脱，分离效果好，重现性强。本测定方法可用于镇咳宁颗粒的质量控制。
参 考 文 献
[1]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海科技出版社,2006:3278.
[2]梁晓天主编.常用中药基础研究(第二卷)科学出版社,2004:378-380.
[3]关福兰,金万宝,章新华等.白花前胡甲素对高钾、乙酰胆碱收缩的离体家兔气管平滑肌的作用[J].中国医科大学学报,1994,23(6):549—552.
[4]何冬梅等.白花前胡药理作用的研究进展[J].药学与临床研究,2007,15(3):167-170.
[5]中华人民共和国药典(一部)[S].北京化学工业出版社.2005:152-153.
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