Tie2在鼠急性肺损伤中的表达及意义
【摘要】 目的 探讨Tie?2在急性肺损伤（acute Iung injury,ALI）中的表达及意义。方法 24只Wistar大鼠随机分为对照组与模型组，每组各12只，对照组采用假手术处理，模型组采用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）制作ALI模型，分别于假手术及CLP术后12 h处死全部大鼠，取右肺石蜡包埋，行HE染色，采用免疫组织化学法检测Tie?2在鼠肺组织中的表达分布。结果 对照组在支气管上皮细胞、平滑肌细胞及内皮细胞表达Tie?2。模型组在肺泡间隔及肺泡腔内中性粒细胞及巨噬细胞均有强阳性的表达，在Tie?2阳性的炎症细胞附壁区域，内皮细胞Tie?2表达亦增强，支气管上皮细胞表达相对减弱，平滑肌细胞表达未见明显差别。结论 ALI模型鼠肺组织中中性粒细胞及巨噬细胞表达Tie?2，同时内皮细胞Tie?2表达增强。
【关键词】 急性肺损伤； Tie?2；盲肠结扎穿孔术
【Abstract】 Objective To explore expression and significance of and Tie?2 receptor in a rat model of acute lung injury. Methods The rat model of acute lung injury(ALI) was made by cecal ligation and puncture(CLP). Wistar rats were devided into control group and model group,and were killed 12 hours after shaming or CLP. Right lungs were embedded in paraffin.The expression and distribution of Tie?2 receptors in lung was observed by Immunohistochemistry. Results Tie?2 receptors were expressed in bronchial epithelial cells，smooth muscle cells and endothelial cells in control group.There were higher expressions on neutrophils and macrophages in lung interstitial and alveolar space. In adhesion location of Tie?2 receptors positive inflammatory cells,there was higher staining in endothelial cells, whereas there were relatively decreased expressions on bronchial epithelial cells. There were no distinct difference on smooth muscle cells between two groups.Conclusion Neutrophils and macrophages express Tie?2 receptors,and meanwhile endothelial cells have higher expressions in the lung of the rat model of acute lung injury.
【Key words】 acute lung injury,Tie?2,cecal ligation and puncture
急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）常是严重感染中毒症(severe sepsis)的严重并发症，病理上表现为肺部大量炎性细胞的浸润，肺水肿的形成。Tie?2为血管生成素（Angiopoietin,Ang）家族受体，研究发现Tie?2在炎症反应中起重要作用，在鼠ALI模型中存在Tie?2表达下降及磷酸化受阻现象［1］，但其具体表达分布不明。本研究通过盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）诱导sepsis制作鼠ALI模型，检测Tie?2在ALI鼠肺脏中的表达分布并探讨其在ALI中的意义。
1 材料与方法
1.1 实验主要试剂 浓缩型Tie?2兔抗鼠多克隆抗体、sABC试剂盒及DAB显色试剂盒均购自中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 实验分组 健康清洁级成年雄性Wistar大鼠24只（山东大学实验动物中心提供），随机分为两组，对照组12只，模型组12只。
1.3 ALI大鼠模型制备及标本处理
1.3.1 ALI大鼠模型制备：术前大鼠禁食12 h，禁水8 h，3%水合氯醛行腹腔麻醉，75%乙醇消毒腹部，沿腹白线中段作一长1.5 cm的切口,剪开皮肤和肌层，探查腹腔分离盲肠，在距盲肠末端1 cm处用3?0丝线结扎盲肠，注意避免结扎盲肠动脉及引起肠梗阻，用16 G穿刺针在盲肠游离面（肠系膜对面）上贯穿3次，针孔间距约3 mm，并挤出少许内容物，还纳肠管。术毕逐层关腹，并于腹壁皮下注射林格液3 ml /100 g抗休克处理。术后自由进食饮水。对照组仅做无菌开腹与盲肠翻动。
1.3.2 标本处理：分别于假手术及CLP术后12 h处死全部大鼠，剪取右肺组织，常规石蜡包埋，HE染色观察肺部病理变化，免疫组化sABC法观察Tie?2表达分布，具体步骤按试剂盒说明操作。
2 结果
2. 1 肺组织病理学变化 对照组大鼠肺脏光镜下肺组织结构清楚，肺间质有仅有少许炎性细胞，肺泡壁结构完整，肺泡内未见水肿液及肺泡萎陷（图1）。模型组光镜下见肺泡间隔增厚，肺间质充血水肿，大量中性粒细胞及少量巨噬细胞浸润，部分肺泡萎缩塌陷（图2）。
2.2 免疫组化病理结果分析 对照组Tie?2主要表达于支气管上皮细胞（图3）、内皮细胞（图4），在支气管及血管平滑肌细胞亦有较弱的表达，肺泡腔未见有明显阳性表达细胞（图5）。模型组支气管上皮细胞表达相对减弱（图6），在Tie?2阳性的炎症细胞附壁区域，内皮细胞Tie?2表达增强（图7），在肺泡间隔及肺泡腔内中性粒细胞及巨噬细胞均有强阳性的表达（图8），平滑肌细胞表达未见明显差别。
3 讨论
众多肺内外因素均可引起ALI，其中sepsis是重要的肺外因素。CLP术由肠源性感染诱导sepsis致ALI，能较好的模拟疾病的自然病理生理过程。本实验大鼠在CLP术后12 h肺脏病理变化以肺泡中隔变化为主，表现肺间质充血水肿，大量中性粒细胞及少量巨噬细胞浸润，肺泡结构破坏，与国外的模型报道相符［2］。Tie?2广泛表达于成人脉管系统中［3］，对维持正常血管完整性有重要作用。Tie?2配体包括Ang?1、Ang?2、Ang?4，其中Ang?1可以激动Tie?2，促进内皮细胞迁移，拮抗凋亡，募集血管周围支持细胞，稳定血管，防止渗漏，Ang?2作用较复杂，通常认为可以抑制Tie?2，对血管起去稳定作用，但在体外实验中高浓度或长时间刺激Tie?2时也可激动受体［4，5］，Ang?4可以激动Tie?2，但研究较少。最新的研究表明,Ang/Tie?2系统在炎症反应内皮细胞活化中起重要作用［6］。
Lemieux等［7］通过RT?PCR、免疫组化及共聚焦显微镜首次发现Tie?2表达于中性粒细胞，且Ang?2可以较弱的激动中性粒细胞Tie?2。在内皮细胞Tie?2的活化可诱导P选择素的定位，导致中性粒细胞粘附能力的增加，而中性粒细胞Tie?2活化可以进一步增强其粘附能力。本研究亦发现在Tie?2阳性的中性粒细胞附壁区域，内皮细胞Tie?2亦染色增强，提示两者Tie?2可能同时存在活化现象。
Murdoch等［8］通过体外细胞实验发现低氧血症能上调单核细胞?巨噬细胞较强强度表达Tie?2，其中组织巨噬细胞有着最强的表达，推断Ang?2可能趋化Tie?2阳性单核细胞的游走至炎症区或肿瘤组织，易化血管新生。本研究亦发现肺泡巨噬细胞高强度的表达Tie?2，在大血管及支气管粘膜下层亦有阳性表达Tie?2的巨噬细胞，这些细胞作用仍不清楚，是否与ALI损伤后组织修复有关有待进一步研究。
综上所述，本研究表明ALI时肺组织中性粒细胞及巨噬细胞表达Tie?2，同时内皮细胞Tie?2表达增强，Tie?2参与了ALI的病变过程。
【参考文献】
［1］ Mahroo M,Thamir N,Salman Q,et al.Regulation of angiopoietin expression by bacterial lipopolysaccharide［J］.Am J Physiol lung Cell Mol Physiol, 2008, 294 (5): L955?963.
［2］ Ozturk E,Demirbilek S,Bege Z,et al.Does leflunomide attenuate the sepsis?induced acute lung injury［J］.Pediatr Surg Int,2008,24:899?905.
［3］ Wong AL,Haroon ZA,Werner S,et al.Tie2 expression and phosphorylation in angiogenic and quiescent adult tissues［J］.Circ Rep，1997,81:567?74.
［4］ Korff T，Kimmina S, Martiny?Baron G,et al.Blood vessel maturation in a 3?dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness［J］.FASEB J,2001,15(2):447?457.
［5］ Teichert?Kuliszewska K, Maisonpierre PC, Jones N,et al.Biological action of angiopoietin?2 in a fibrin matrix model of angiogenesis is associated with activation of Tie2［J］.Cardiovasc Res，2001,49:659?670.
［6］ Fiedler U,Reiss Y,Scharpfenecker M,et al.Angiopoietin?2 sensitizes endothelial cells to TNF?alpha and has a crucial role in the induction of inflammation［Ｊ］.Nat MED, 2006, 12(2):171?172.
［7］ Lemieux CR,Maliba J,Favier JF,et al.Angiopoietins can directly activate endothelial cells and neutrophils to promote proinflammatory responses［J］.Blood, 2005,105 (4):1523?1530.
［8］ Murdoch C,Tazzymans,Webster S,et al.Expression of Tie?2 by human monocytes and their responses to angiopoietin?2［J］.J Immunol, 2007,178(11):7405?7411.
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