硝酸甘油减轻对乙酰氨基酚肝毒性的作用与机制
作者：任利君 弥曼 宁养红 李汾 李新华【摘要】 目的: 研究硝酸甘油(GTN)对对乙酰氨基酚（AP）肝毒性的影响与机制. 方法： 小鼠ip GTN 0.1~1.6 mg/kg，15 min后ip AP 300 mg/kg，6 h后测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)；GTN（1.6 mg/kg）预处理小鼠，测定AP半数致死量（LD50）；荧光法测定肝蛋白S?亚硝基化水平；分光光度法测定肝谷氨酸脱氢酶(GDH)活性；S?亚硝基谷胱甘肽（GSNO）处理GDH纯酶，Saville?Griess法测定其S?亚硝基化水平，并观察对N?乙酰?p?苯醌亚胺（NAPQI）灭活GDH效应的影响. 结果： GTN降低AP导致的ALT，AST升高，使AP对小鼠LD50由321 mg/kg上升至762 mg/kg；GTN引起肝蛋白S?亚硝基化水平升高，使AP对肝GDH的抑制作用完全消失；GSNO诱发GDH纯酶发生S?亚硝基化，且不影响酶活性，但修饰后的GDH不被NAPQI灭活. 结论： GTN可减轻AP肝毒性，其机制与诱发肝蛋白巯基S?亚硝基化，减少NAPQI与蛋白（如GDH）巯基的共价结合有关.
【关键词】 对乙酰氨基酚；硝酸甘油；S?亚硝基化；谷氨酸脱氢酶；肝毒性；肝/药物作用
0引言
对乙酰氨基酚(acetaminophen, AP)过量致肝实质细胞向心性坏死是西方国家急性肝功能衰竭的首要病因［1］．目前认为，过量AP经肝P450酶系代谢活化，产生N?乙酰?p?苯醌亚胺［N?acetyl?p?benzoquinone imine,(NAPQI)］，后者迅速与还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的巯基结合，使其耗竭后进而与蛋白巯基结合，破坏蛋白功能而引发毒性. 补充GSH是较为满意的防治措施［1］. 本研究选用硝酸甘油（glyceryl trinitrate，GTN)诱导肝蛋白巯基发生S?亚硝基化修饰［2］，以保护蛋白巯基，减少或避免NAPQI攻击，观察是否可减轻AP肝毒性.
1材料和方法
1.1材料AP，NAPQI，2,3?二氨基萘（2,3?diaminonaphthalene, DAN），Griess试剂，牛肝谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)(美国Sigma公司)；5?磺基水杨酸（5?sulfosalicylic acid，SSA），GSH，氯化汞（HgCl2），亚硝酸钠(美国Amresco公司)；谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST）活性测定试剂盒（宁波亚太生物技术有限公司）；GTN注射液（山东华信制药有限公司）；超滤管（美国Millipore公司）；预装脱盐柱，荧光分光光度计，紫外分光光度计(美国Bio?rad公司)．雄性昆明小鼠，体质量18~20 g，由西安交通大学实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1动物实验方案实验一:80只小鼠，禁食不禁水10 h，随机分为8组，每组10只，分别ip给药：GTN(0.1, 0.4, 1.6 mg/kg)，AP(300 mg/kg)，GTN+AP（先注射GTN，15 min 后注射AP），对照组ip等体积生理盐水. 给药后6 h摘眼球取血，制备血清，按照试剂盒说明书测定ALT和AST活性；同时取肝脏，称质量后剪碎，以5倍体积50 mmol/L磷酸缓冲液(pH=7.4)匀浆，1000 g离心10 min，保留上清，取100 μL 测定GDH催化活性，其余样品脱盐后测定蛋白S?亚硝基化水平. 实验二：测定LD50，采用140只小鼠，随机分为14组，每组10只，禁食15 h，其中7组ip GTN 1.6 mg/kg，另7组ip等体积生理盐水，15 min后均ip AP：生理盐水组AP剂量分别为800，571，408，292，208，149，106 mg/kg，GTN预处理组AP剂量分别为1500，1071，765，547，390，279，199 mg/kg；AP加热至50℃溶解，给药容积为15 mL/kg；观察给药后24 h内各组小鼠死亡率，计算LD50.
1.2.2GDH催化活性测定按照文献［3］进行.
1.2.3荧光法测定肝蛋白S?亚硝基化水平蛋白浓度调整为5 g/L，取1 mL进行实验，样品等分为二，一份加入HgCl2分解S?亚硝基化蛋白，释放一氧化氮（nitric oxide, NO）与DAN（溶解于0.62 mol/L HCl）反应，生成荧光物质，另一份加入HgCl2的溶剂作为对照，样品调pH为中性后加SSA沉淀蛋白，离心取上清，测定荧光强度，激发波长380 nm，吸收波长450 nm，以亚硝酸钠做标准曲线，折算蛋白S?亚硝基化水平［4］.
1.2.4S?亚硝基谷胱甘肽（S?nitrosoglutathione，GSNO）的合成与定量200 mmol/L亚硝酸钠与200 mmol/L GSH（均溶解于0.5 mol/L HCL）等体积混合，室温避光反应5 min，得红色产物，用1 mol/L NaOH调pH至中性，以消光系数定量［5］.
1.2.5GDH与GSNO及NAPQI反应GDH透析除去硫酸铵，蛋白浓度调整为1 g/L，取1 mL与等体积GSNO（终浓度0，20，200，2000 μmol/L）室温避光反应30 min，采用脱盐柱去除过量GSNO，一半样品用于测定GDH催化活性，并以Saville?Griess法测定酶蛋白S?亚硝基化水平［6］，剩余样品调整蛋白浓度为0.25 g/L，取1 mL加入NAPQI 1 μL，使其终浓度为10, 30, 90 μmol/L， 室温反应30 min，利用超滤管进行脱盐浓缩，测定GDH催化活性与S?亚硝基化水平［6］；上述实验均重复5次.
统计学处理：数据以x±s表示，用SPSS 13．0软件包进行方差分析(ANOVA)，多重比较采用LSD?t检验法，组间方差不齐时，采用非参数秩和检验法，采用Bliss法计算LD50.
2结果
2.1GTN改善AP导致的血清生化指标改变小鼠单独注射AP 300 mg/kg，血清ALT和AST较对照组均升高（P<0.05）；单独注射GTN，各剂量组均不影响ALT和AST活性；GTN与AP合用，血清AST和ALT较单用AP降低（P<0.05），但与对照组比较，ALT和AST仍偏高（P<0.05，表1）. 在GTN剂量方面，预实验发现，GTN剂量达到50 mg/kg时，小鼠全部死亡；剂量小于0.05 mg/kg时，保护作用几乎消失；剂量大于2.0 mg/kg 时, 保护作用逐渐减弱. 表1硝酸甘油和对乙酰氨基酚对小鼠血清生化指标的影响
2.2GTN成倍提高AP的LD50选用GTN保护作用最强的剂量1.6 mg/kg，测定预处理对AP LD50的影响，发现单用AP对小鼠的LD50为321 mg/kg，95%可信限为(262～394）mg/kg，而GTN预处理后，AP的LD50升高至762 mg/kg，95%可信限为(618～969）mg/kg.
2.3GTN对肝蛋白S?亚硝基化水平和GDH酶活性的影响正常小鼠肝脏（对照组）存在一定量的S?亚硝基化修饰蛋白，AP处理后其水平未见统计学变化，而GTN预处理使其较对照组升高（P<0.05），GTN与AP合用组S?亚硝基化水平也高于对照组（P<0.05）；单独AP给药使肝组织GDH催化活性明显降低（P<0.05），单独注射GTN对GDH催化活性没有明显影响，而GTN与AP合用时，GDH催化活性较单用AP升高（P<0.05，表2）. 表2硝酸甘油和对乙酰氨基酚对肝蛋白S?亚硝基化水平及GDH活性的影响(
2.4GSNO诱导GDH纯酶发生S?亚硝基化并保护其不被NAPQI灭活GDH纯酶与生理盐水（对照）体外孵育，用Saville?Griess法检测不到S亚硝基化修饰， 与GSNO孵育反应后，GDH发生了S?亚硝基化修饰，但该修饰并不影响酶催化活性；AP代谢产物NAPQI明显抑制GDH纯酶的催化活性(P<0.05)；而GSNO(200 μmol/L)预处理可完全对抗NAPQI的抑制作用（表3）. 表3GSNO和NAPQI对GDH纯酶的修饰及功能影响 3讨论
本研究表明，GTN可减轻AP肝毒性，这对临床合理、安全用药具有一定地指导意义. AP是应用广泛的解热镇痛药，多种抗感冒复方制剂均含有AP，服用这类药物具有潜在的肝毒性. 本研究结果提示，同时服用GTN可望降低该风险；短期服用GTN几乎没有副作用，因而二者合用不会增加新的不良反应；尤其对于经常服用GTN的心血管病患者，提醒其服用GTN后再服用含AP的各种制剂，可能会对患者有所裨益. 必需指出，本研究动物实验的结果尚不能直接外推到临床用药，但可为相关临床试验提供一定理论依据.
AP肝毒性的机制主要与蛋白巯基被破坏有关，例如GDH的巯基可与NAPQI结合而导致酶活性降低［7］. 本研究发现，一氧化氮供体GSNO在体外可诱导GDH发生巯基S?亚硝基化，防止其被NAPQI灭活，同时GTN也可防止GDH在体内被AP灭活，提示GTN降低AP肝毒性的作用机制与诱发肝蛋白发生巯基S?亚硝基化，保护巯基以维持蛋白正常功能有关.
GTN减轻 AP肝毒的作用与机制，可望揭示一种全新的肝细胞保护机制. 文献报道，肝组织靶向性的外源NO供体以及内源性过量产生的NO，均可减轻AP肝毒性，但其作用机制尚未完全明确，本研究提示NO可能通过增加蛋白S?亚硝基化、减少NAPQI共价结合而发挥护肝作用. 另外，在半乳糖胺诱发的肝细胞损伤过程中，伴随有显著的蛋白S?亚硝基化升高［8］，但其生物意义不明确，本研究提示，这种应激性的S?亚硝基化升高，可能是机体的一种自发保护机制.
本研究结果显示GDH是一个全新的S?亚硝基化蛋白靶点，但该修饰并不影响其催化活性. 此前报道的诸多蛋白靶点，均可通过S?亚硝基化修饰而调控功能改变［9］，而不影响功能的修饰往往被忽视，迄今尚未见任何文献报道. 本研究表明，不影响蛋白功能的S?亚硝基化同样具有重要生物学意义，可保护巯基，使其不受有毒活性物质攻击，维持蛋白在应激状态下的正常功能，这对S?亚硝基化研究领域提供了新的思路.
【参考文献】
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