组织芯片的手工制作技术及其应用
作者：朱玉红 吕增华 张祥盛【关键词】 手工组织芯片；芯片；HE染色；免疫组化染色
组织芯片又称组织微阵列，是将数十个、数百个乃至数千个小的组织片整齐地排列在某一载体上（通常是载玻片）而成的微缩组织切片［1］。该切片体积小，信息含量大，可以进行HE染色、特殊染色、免疫组织化学染色和原位杂交等，一次实验即可获得大量信息，大大节约了组织原材料和检测试剂，减少了实验误差，增强了可比性，操作简便［2］。但组织芯片制作技术一般采用进口的组织微阵列仪或组织芯片制作机，这些仪器价格昂贵，不适于基层单位使用。为此我们尝试手工方法制作组织芯片，并取得了较好的效果。现介绍如下。
1 材料与方法
1?1 标本来源 收集2004年1月—2005年10月间我院胸外科送检的肺肿瘤组织石蜡标本106例，其中腺癌36例，鳞癌30例，小细胞癌30例，瘤旁正常肺组织10例。
1?2 方法
1?2?1 组织处理：所有标本经4%的甲醛固定，正常组织处理，石蜡包埋，并常规切片HE染色。
1?2?2 组织芯片的基本制作过程：①自制打孔针和取样针：60 ml注射器针头2个，其内径为1.5 mm，分别用于打孔和穿取组织。介入治疗科用穿刺针1个，其内径1?4 mm 。用锯片将3个针末端的针尖锯成平端，且使穿刺针比注射器针略长1~2 mm并将其末端磨圆，便于钻取蜡块后将注射器针内的蜡芯完整推出。②收集和选择病例：首先应根据已有研究课题收集和选择病例。复查组织切片，审查病理诊断，标记组织中的靶点(即欲取组织点)并在切片上面画圈标记。选择相应组织蜡块(称为供体蜡块donor)标记相应靶点并画圈。③受体蜡块的制作：将56~58℃石蜡(上海华灵公司产品)经多次反复溶化后过滤，注入模具内，制成空白蜡块，选用模具大小可根据打孔的多少而定。打孔前先用载玻片在受体蜡块表面划定界限，根据样本多少决定打孔数目和区域，并用直尺划出网格线。④组织蜡芯的获得与植入：将供体蜡块组织面朝下放入45℃恒温水浴锅中1 min，组织块受热不仅易于钻取且不会破坏其周围组织，最大程度减少对供体蜡块的破坏，用另一打洞针在蜡块的标记部位打洞采集组织芯。组织芯推出后，直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空洞内。有时因为标本的原因，钻取的组织蜡芯仅部分有组织、部分为空白时，可以在毗邻处重复钻取，切除空白部分，将前半截有组织蜡芯装入孔内，用穿刺针针芯送入底部后再装入另一个有组织的半截蜡芯，并用针芯适当填捣，两截间不留间隙，以保证切片时每一孔标本都能切到。⑤组织芯片的表面平整：在微阵列排好以后，可以发现样本高低不平，此时可以将受体石蜡块放在60 ℃的烤箱中10~15 min，然后用一个载玻片下压平整，注意要均匀下压［3］。⑥ 受体蜡块与组织蜡芯的融合：将做好的蜡块有组织的一面朝下放入模具内，置入60 ℃烤箱内1 h，使两者重新溶为一体，在这个过程中，每10 min观察一次，既要保证组织芯和蜡融合在一起，又要防止TMA蜡块完全溶解、组织排列混乱而无法使用。组织芯和蜡融合好后轻轻地从烤箱中取出模具,让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入冰箱冷冻后,将组织芯片蜡块从模具中取出，至此，组织芯片蜡块便制做成功。⑦切片 ：修正蜡块，用冰块冰组织面，连续5 μm厚切片，40 ℃温控漂烘仪裱片，用于免疫组化染色的组织切片裱于经多聚赖氨酸溶液处理的载玻片上，56 ℃烤片3 h后移至37 ℃恒温箱中过夜。
1?2?3 免疫组织化学染色：对已制作好的组织芯片进行免疫组织化学染色，采用即用型ElivisionTM plus法，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH=6.0)高压煮沸抗原修复，PBS缓冲液冲洗，一抗4℃冰箱过夜。DAB显色，苏木素复染，选用的抗体有MMP?9、Ki67、PCNA、CD147、VEGF等。以上试剂均由福州迈新生物技术开发公司提供。
2 结果
2?1 组织芯片的质量 本实验2个组织芯蜡块共切片10张，载玻片上组织阵列整齐，530个微组织块有8块脱失，3块组织有部分折叠，其余组织形态保存完好。
2?2 免疫组织化学染色 Ki67、PCNA阳性反应呈棕黄色，定位于细胞核上；MMP?9、CD147、VEGF阳性反应定位于细胞浆，显色清晰，背景干净。3 讨论
组织芯片容纳的信息量大，一张玻片可排列数十到上千个样本，一次完成实验，既省时、省力、节约试剂，又减少了实验误差，增加了结果的准确性、可比性和可靠性。我们用手工方法制作组织芯片，只需60 ml注射器针头和介入治疗科废旧穿刺针，工具简单，适于在基层院应用。 组织芯片制作过程中最常见的现象是目标蜡块损坏、无效组织、组织缺失、折叠、移位和飘散。为此，应注意以下几个问题：①对目标蜡块的保护：在微阵列蜡块的制作中，由于要从目标蜡块中钻取组织，在钻取中不可用力过猛，应当匀速钻取，也可以把蜡块放入45~50 ℃的热水中浸泡数秒钟再钻取目标组织,这样可防止损伤组织，钻取组织结束后,为了保护蜡块可将钻孔用蜡密封。②用针直接在冷却后的蜡块上打孔不容易成功，因为很容易使蜡块碎裂或造成相邻孔的贯通。实践中我们发现对于熔点为58 ℃的石蜡，置于45 ℃的恒温水浴锅内2 min左右，在蜡块微微变软时打孔效果好。③供体蜡块的厚度及其制作过程直接影响到芯片的质量。由于存档蜡块经反复使用，组织厚薄不一，组织芯易出现漏取或深浅不一，另存档蜡块的制作不尽相同，质量参差不齐，从而降低了组织芯片的利用率。所以在平时工作中应严格按照操作指南进行，临床组织标本的制作或针对组织芯片构建的需要，专门留取相应组织，将组织取材为1.5 cm×1.0 cm×0.4 cm，手工脱水、透明、包埋,保证供体蜡块的质量。④无效组织的处理：所谓无效组织包括以下两种：一是指在目标蜡块中定位不准确，未取到目标组织。避免的办法是病理诊断医师负责切片的诊断，准确找出所需区域并作出相应标记；病理技术人员熟练掌握芯片制作方法，病理诊断医师与病理技术人员密切合作是避免无效组织的关键。二是组织厚度不够，在HE切片下有所需组织，但由于组织太薄，再修整后已没有所需组织，避免的办法是尽可能选择组织块较厚的蜡块，或针对组织芯片构建的需要，取材时留取相应组织。⑤组织切片时，为减少多次修块而造成的组织损耗和浪费，要一次多切片直至将组织切完。5 μm厚的芯片，可一次切片100~200张，切片可保存于-20℃~-40℃冰箱中备用。如需较长时间保存，则可用少量融化的石蜡滴封每张切片后-20℃保存，染色时可适当延长脱蜡时间，18个月内未见对免疫组化或原位杂交结果有任何负面影响［4］。⑥漂片时可将切片先漂在凉水中，让其自然展开，然后转移至45 ℃温水中漂片，再贴于涂有多聚赖氨酸的玻片上。漂片水温要适宜，温度过高组织片易离散，温度过低则难以保证组织片的充分展开。文献报道的胶带粘贴紫外线转移法可以有效地避免组织移位和脱落［5］，但该方法胶带从玻片上分离时很困难，同时常常会带一部分组织下来，价格昂贵又费时，不适用于基层医院。⑦因考虑到一些细胞尤其是肿瘤细胞的异质性问题，为使挖取组织块能更全面的代表原组织蜡块的结构，并保持组织完整性，我们采取了直径1.5 mm组织样本，理论上可包含4 000~20 000个细胞，足以反映原组织结构的信息。本实验我们尝试将组织芯片技术应用在免疫组织化学染色上，将106例肺组织标本做成2个组织芯蜡块，通过一次免疫组织化学染色即完成。充分体现了其高效、快速、低消耗、实验误差小和可比性强的特点。总之，组织芯片技术还处在不断完善的过程中，在实际工作中我们要不断的总结经验，改进制作技术，将组织标本的消耗降到最低，从而提高组织芯片的利用率，拓宽组织芯片的应用范围。
【参考文献】
［1］ Kononen J,Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue microarrays for high?throughput molecular profiling of tumor specimens［J］.Natl Med,1998,4:844?847.
［2］ 朱明华.组织微阵列及其在肿瘤病理研究中的应用［J］.中华病理学杂志,2002,31:72?73.
［3］ 张诗武，张永亮，魏焕萍，等.组织芯片技术及其应用［J］.武警医学院学报,2002,11(2):125?127.
［4］ 孙保存，张诗武，赵秀兰，等.组织芯片制备过程中的体会和注意事项［J］.临床与实验病理学杂志,2002,18:658?659.
［5］ 倪灿荣，李芳梅，朱明华，等.提高组织芯片切片成功率的方法和体会［J］.中华病理学杂志,2002,31:559?560.
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