流式细胞术在临床研究方面的应用

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流式细胞术在临床研究方面的应用

                                     作者：韩兆东阮月芹安新业孔祥华陈佳荣周玉明

【关键词】  细胞
　　【关键词】  流式细胞仪；临床应用；流式细胞术
    流式细胞术（flow cytometry,FCM）是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物特性进行分析的方法。流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的综合结晶。在免疫学、血液学、肿瘤学等学科及临床研究方面得到广泛应用［1］。
　　FC500是由美国贝克曼库尔特（BECKMAN COULTER）公司2003年推出的临床及科研型流式细胞仪系统。该仪器可同时测定前向散射光（FORWARD SCATTER）、侧向散射光（SIDE SCATTER）及利用一个488 nm单束激光激发五个荧光染科所产生的荧光信号。因此，该仪器可对各个细胞进行相关的多参量的分析。
　　FCM的应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞的分子水平的研究，随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。
　　1  FCM在免疫学中的应用
　　FCM广泛地应用于检测各种免疫细胞的表面标志及细胞内各种细胞因子等，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，指导治疗。有大量文献介绍了淋巴细胞在各种疾病中的变化。正常人群T淋巴细胞CD4/CD8比值大约为2∶1，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例下降甚至倒置。B细胞CD19与机体免疫球蛋白呈正相关。NK细胞反应机体对病毒感染的细胞和肿瘤细胞的杀伤能力及巨噬细胞的杀菌活性。FCM通过对人白细胞抗原（HLA）配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体并进行骨髓或器官移植后免疫状态的监测。外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大程度的相关性，运用HLAB27/HLAB7双标记特异性单克隆抗体检测抗原，可同时排除交叉反应，其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高［2］。用FCM检测阵发性睡眠性血红蛋白尿患者血细胞细胞膜上的CD55、CD59已能从病理上提供直接的证据，比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度。用FCM检测红细胞、粒细胞抗体及血小板表面的相关抗体，对确诊自身免疫性贫血、粒细胞减少症及血小板减少性疾病，均具有检测速度快、灵敏度高、特异性好的优点［2］。
　　2  FCM在血液学中的应用
　　白血病分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充；是对白血病诊断、选择化疗方案和判断预后的重要依据；对白血病发病机制的研究也具有重要作用。由于白血病不同系列、不同分化阶段血细胞膜表面及浆内表达不同的分化抗原，且与相应正常骨髓细胞的表达存在差异，故应用FCM能很好的对白血病进行免疫分型，并能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息，而这种变化常常是细微的，以至于常规FAB方法不能分辨。这使我们对血液肿瘤细胞的生物学特征有了更深入和更精确的认识。FCM还可用于血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断，包括先天性或获得性血小板的疾病，评价活化血小板程度在血栓疾病和血栓前状态发生发展中的作用。用FCM通过对外周血网织血小板的测定，有助于血小板减少症的病因学诊断。可作为骨髓移植、造血促进因子和骨髓移植后骨髓血小板造血恢复有用的监控指标。
　　应用FCM检测某些免疫指标，能对再生障碍性贫血的发病机制进行研究。再障是一组由不同发病机制介导的骨髓造血功能障碍综合征。其发病机制复杂，目前尚未完全明了，但越来越多的临床和实验室证据表明免疫介导的造血抑制，是再生障碍性贫血最常见的病理之一。而且，具有免疫表型异常（如CD4/CD8倒置、CD8+活化T细胞或TCRγ，δ等异常增高）的患者临床表现相对严重，但免疫治疗相对有较好的疗效。微小残留病灶（MRD）检查：白血病病人在获得血液学缓解后，体内还存在1010以下的白血病细胞。这样少量的白血病细胞常规的显微镜不能检出。在强化治疗和维持治疗后可逐步减少，但难以彻底清除，这是复发的根源。检测MRD是决定进一步治疗策略和选择采集外周血造血干/祖细胞自体移植及异基因骨髓移植时机的依据。
　　多发性骨髓瘤（MM）：多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生性疾病，正常浆细胞为CD38+/CD45 dim-，使用CD38/CD45双标记检测外周血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。通常使用CD38和CD45，结合轻链检查，对多发性骨髓瘤细胞进行分析。另外，正常浆细胞的表面标记为CD19+/CD56-，而多发性骨髓瘤细胞通过为CD19-/CD56+。这样，使用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进行多参数分析，并计算浆细胞含量，对于多发性骨髓瘤的诊断和治疗评估有重要意义。
　　CD34的绝对计数：造血干/祖细胞移植加强烈化疗是治愈某些难治性疾病的有效方法；它不仅可以用于某些恶性血液病的治疗，而且还可以用于其他恶性实体瘤的治疗。骨髓移植（BMT）或外周血造血干细胞移植（PBSCT）的成功与否，除了与是否合并并发症有关外，移植物中CD34+细胞的数量和质量是快速成功植活的重要因素。精确测定CD34对于判断移植后的植活和选择GCSF动员外周血干细胞的采集时间，有着重要指导意义。
　　3  FCM在肿瘤学中的应用
　流式细胞术利用实体瘤标本或穿刺标本、胸腹腔液体、膀胱冲洗液、尿液、食道镜及支气管镜钳取的少量活检组织等对肿瘤细胞DNA会计师测定，解析细胞周期，通过肿瘤细胞异倍体测定，鉴别良性与恶性肿瘤，预测各种癌的预后，并能在化疗中对药物的选择，放疗中强度、时间的决定等起主要作用［5］。根据细胞周期分析结果，适当选用周期特异性药物或非周期特异性药物，可协助拟定治疗方案；根据化疗过程中肿瘤细胞DNA会计师分布直方图的变化，可了解细胞动力学变化，以此评估药物疗效。
　　多药耐药（MDR）的研究：白血病治疗及肿瘤化疗的失败在很大程度上是由于白血病细胞及肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药。因此，对白血病和肿瘤细胞耐药机制的研究具有重要的意义。但耐药的形成过程很多，主要有几个方面，包括药物吸收减少、细胞解毒作用增强、靶分子改变、DNA损伤修复能力增强、细胞内药物溢出增多、细胞凋亡的抑制等。多药耐药基因编码的P糖蛋白，是白血病细胞及肿瘤细胞抗药性的分子学基础，也是影响化疗疗效的主要障碍。利用FCM检测多药耐药基因，则可为药理学研究提供依据。
　　参  考  文  献
　　1左边富流式细胞术与生物医学［M］沈阳：辽宁科学技术出版社，1996129~422
　　2单卫民，冯萍，俞秋兴流式细胞仪检测HLAB27［J］临床检验杂志，2000，18（6），366
　　3Jennnings CD,Foon KARecent advances in flow cytometry;application to the diagnosis of hematologic malignancy［Ｊ］Blood,1997,90(8);2863
　　4韩悦，王兆钺，朱明清，等血小板血身抗体的流式细胞仪检测与意义［J］临床血液学杂志，2000，13（5）:222
　　5沈兰兰，萧树东流式细胞仪技术在消化道肿瘤中的应用［J］引进国外医药技术与设备，1999，5（2）: 19

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