脐血造血干细胞移植的相关免疫分析
作者：彭新国 陈佳荣 李占全
【关键词】 细胞
【关键词】 脐血干细胞；移植；免疫治疗
脐血造血干细胞移植融化疗与免疫治疗于一体，作为血液恶性疾病的治疗手段已获公认，其重要原因就是脐血造血干细胞移植比其他造血干细胞移植具有诸多优点：来源丰富、取材简单；对供、受者HLA相符的要求相对较低；不易受病毒及残留肿瘤细胞的污染；CD3、CD4相对不成熟，GVHD发生率低；NK细胞、LAK细胞较多，GVL发生率低；增殖、自我增殖能力强；骨髓基质细胞多，给造血干细胞提供生长的微环境等。造血干细胞移植的临床快速发展丰富了移植免疫理论，移植免疫的进展亦促进了造血干细胞移植的临床实践。脐血造血干细胞移植亦存在诸多免疫方面的问题，如GVHD、GVL、免疫耐受等发生率虽较低但均有其免疫的机制。为更好地理解、认识及进一步解决这些问题，本文将从相关免疫学的角度对这些现象作一综述。
1 T细胞抗原识别和激活的分子基础
脐血造血干细胞移植时，由于受者在移植前接受了预处理的超大剂量放/化疗，受者免疫受到抑制，因此，更多的情况是发生供者对受者的免疫反应，供者的T细胞被激活。T细胞可通过特异性和非特异性抗原两条途径被激活。在移植免疫中起重要作用的是抗原特异性激活。抗原特异性激活需要T细胞与“专业化”的抗原递呈细胞（APC）反应。APC在不同条件下由不同细胞组成，主要包括树突状细胞、巨噬细胞、激活的B细胞、单核细胞等。T细胞的激活可人为地分为三个阶段：第一阶段为粘附：APC与T细胞通过细胞表面粘附分子及其配体在外周血与淋巴细胞随机接触发生反应。细胞表面粘附分子包括LFA3及其配体CD2、ICAM1、LFAⅠ等。第二阶段为识别：在粘附的基础上，若APC可呈递足够量的特异性抗原多肽给T细胞，则T细胞可通过T细胞受体对抗原进行识别。T细胞受体抗原的识别受MHC限制性，内源性抗原肽通过MHCⅠ类分子提呈给CD8+的TCR，外源性抗原肽通过MHCⅡ类分子提呈给CD4+的TCR。第三阶段为T细胞的激活：TCR与抗原肽的结合使T细胞具备被其它信号激活进而分化、增殖和分泌细胞因子的能力；但若缺乏其它信号的刺激，则不能被激活或发生增殖和分泌细胞因子。TCR与抗原的结合是T细胞激活的第一信号，第一信号具有抗原特异性和MHC限制性；第二信号则是非特异性的：CD28仅局限表达于T淋巴细胞和浆细胞，但直到80年代末期、90年代初期才确定了CD28在APC表面的配体B71（CD80）、B72（CD86）。越来越多的资料显示，B71和B72途径可能传递不同的共刺激信号。也有证据显示B7家族中可能尚有其它组成成份。这些分子的发现无疑会对B7/CD28共刺激信号乃至免疫激活的理论发生冲击。因此，T细胞通过粘附分子与APC接触，进而识别APC呈递的抗原多肽。通过B7/CD28等多个黏附分子对传递第二信号，进而T细胞被激活发生增殖、分泌不同的细胞因子。T细胞激活后表面表达另一分子――CTLA4，结构与CD28类似，但与B7分子结合后发挥的作用与其相反，在共刺激信号中发挥重要的负调节作用，抑制T细胞过度增殖。因而通过调控粘附分子、第二信号系统，可以改变免疫反应；若阻断粘附分子或TCR与抗原的接触，则T细胞发生抗原识别的最终结果是免疫抑制；这些细胞再次遇上特异性抗原，仍会发生免疫反应；但若调控发生在B7/CD28阶段，则结果完全不同，这些细胞由于已与特异性抗原肽发生接触，此时阻断第二信号B7/CD28，则细胞进入一长久的特异性免疫无反应状态，即使再次遇上此抗原，仍无法发生免疫应答反应［１～３］。
2 免疫耐受
宏观上讲，有三条途径可以达到免疫耐受。第一是克隆清除，第二是克隆失能，第三是免疫抑制。同其他大器官移植不同，异基因造血干细胞移植最终可不必使用免疫抑制剂而达到免疫耐受。虽然确切的免疫耐受机制尚未完全阐明，但临床和实验室资料支持上述三种机制并存。例如，慢性GVHD病人存在特异性对宿主起反应的供者淋巴细胞，而无慢性GVHD的病人则无此类细胞。换言之，在无慢性GVHD的受者，针对宿主的淋巴细胞被克隆清除或克隆失能。同样，在动物试验中，有急性GVHD表现的动物体内可发现特异性对宿主抗原反应的T细胞克隆。而在无急性GVHD的动物则极难分离出上述T细胞克隆。当然，也有第三种机制参与免疫耐受机制及免疫抑制的证据：临床及动物试验发现有抗原特异性和抗原非特异性免疫抑制细胞的存在，免疫抑制药物对造血干细胞移植免疫耐受形成的重要性等均支持免疫抑制机制的参与。由于免疫耐受对造血干细胞移植的重要性，近年全世界科技工作者花费大量的财力、物力和人力对免疫耐受进行了研究，试图在免疫耐受机制和诱导免疫的方式上取得进展。
2.1 免疫抑制剂的进展
用于造血干细胞移植的免疫抑制药物主要是环孢素A。环孢素A的应用使移植的免疫合并症明显减轻，使移植疗效大为改进。近年来，大环内酯类抗生素FK506、MMF等新型免疫抑制剂的应用，有望进一步提高移植的安全性。尤其是FK506能使HLA不合的造血干细胞移植形成免疫耐受。上述药物可分别通过抑制某些细胞因子（尤其是IL2）的产生，阻断细胞因子与受体的结合，干扰细胞因子受体的表达等机制而发挥免疫抑制作用［４，５］。
2.2 特异性免疫耐受的诱导
迄今为止，仅在动物模型上获得成功。脐血移植属异基因造血干细胞移植，以下两方面的进展值得一提：①通过阻断共刺激信号即第二信号，诱导免疫耐受。如前所述，T细胞的激活需第一、二信号；CD28/B7在第二信号中发挥重要作用。应用阻断CD28/B7的制剂，可干扰T细胞的特异性激活，细胞进入免疫无能状态；CTLA4Ig或B7抗体可用来达到此目的。动物实验表明，必须完全阻断B7家族的信号传导，方能诱导MHC不合的免疫耐受；体内应用CTLA4Ig虽能明显降低MHC不合移植致死性GVHD发生率，但并不能完全消除致死性GVHD。体内体外联合阻断B7/CD28信号传导可能会获得更好的结果。②基因工程。供者T淋巴细胞是GVHD的关键细胞，体外去掉之无疑会减轻GVHD，但同时会使异体植入发生困难，尤其是HLA不合的异基因造血干细胞移植。由于认识到植活主要是T细胞的早期功能事件，而GVHD往往是植活以后发生。因此近年有学者试图用基因工程的方法诱导免疫耐受；体外将标记基因重组到供者T淋巴细胞上，后者与DHPG接触后即出现凋亡。结果既能保证植活的需要，而且一旦发生GVHD则可应用DHPG输注诱导T细胞凋亡，阻止GVHD的发生。③嵌合体形成免疫耐受。动物实验证实，用CD4单抗对受者进行的非清除性造血干细胞移植可形成供受者嵌合，若供受者形成嵌合体状态，则不易发生GVHD，其机制虽未获阐明，很可能是T细胞克隆被清除或有veto细胞的存在。最大的问题是如何设计一有效的非清除性方案使之能形成嵌合状态。临床应用非清除性造血干细胞移植在HLA相合的异基因移植获一定成功，但未能完全避免GVHD，提示人与动物实验仍有一定差异。此一方法能否跨越HLA不合的免疫屏障，尚有待进一步临床证实［６～１２］。
3 急性GVHD
急性GVHD是异基因造血干细胞移植的主要合并症，其发生的基础在于供受者MHC及次要组织相容性的差异。有关其发生的细胞和分子机制近年已越来越清楚。由于受者机体处于免疫抑制状态，供者T细胞（主要是成熟T细胞）被激活。激活的过程同上。由于预处理并不能安全清除受者APC，故受者APC直接将MHC或次要组织相容性抗原处理为多肽后呈递给供者T细胞。供者T细胞被激活分泌大量细胞因子，如IL2及其受体。这些因子一方面可刺激T细胞的增殖和细胞因子再分泌，另一方面尚可促进APC的活性及其他分子的分泌，如粘附分子、MHC的高表达等。
T细胞激活后如何导致组织的损害尚有诸多不甚清楚之处。早年认为细胞毒性T细胞直接导致组织损害和坏死。然而，此一假设近年渐被搁置。越来越多的试验证据表明，大颗粒细胞――NK细胞无疑对GVHD的组织损害发挥一定作用；细胞因子如TNF、IL1等对GVHD组织损害的作用也越来越获肯定［１３，１４］.
4 慢性ＧＶＨＤ
慢性GVHD由于有类似于胶原血管炎性疾病的临床表现，一般认为与急性GVHD不同，更可能是一种自身免疫性疾病。早期常以100 d作为鉴别急、慢性GVHD的标准。但近年的资料表明，慢性GVHD应更好地从临床、病理和发病机制方面加以认识。虽然从临床的角度非常难确定GVHD与自身免疫的关系，动物试验已证实慢性GVHD呈自身免疫性疾病的病理生理过程。在动物模型中，源于慢性GVHD的T细胞特异性对MHCⅡ类分子的公共抗原簇发生反应，既使在无IL2的条件下仍可分泌因子IL4和IFNγ，并且刺激纤维母细胞产生胶原蛋白。GVHD的发生可能与受体胸腺功能受到破坏，使之不能对针对自身抗原的T细胞实行克隆清除，后者由供者造血干细胞分化而成［15］。
5 同基因GVHD
病理改变类似慢性GVHD。动物模型研究表明，其发生机制是由于自身免疫性T细胞针对MHCⅡ类抗原分子。自身免疫性T细胞发生的机制是由于胸腺严重受损，髓质（Medulla）内缺乏表达MHCⅡ类抗原的细胞，因而在胸腺内发育成熟并移至外周血的T淋巴细胞可以导致组织损害，而其他可以灭活自身免疫的免疫监视细胞又由于预处理（如放射线）而遭灭活。将正常淋巴细胞回输给照射后的动物宿主，可以恢复宿主的调节功能，从而预防此免疫过程。环孢素A由于可以阻止此免疫监视机制的重建，因而在诱发同基因（或自体）GVHD中起重要作用［１６］。
6 GVL效应
诸多事实证明移植物抗白血病效应（GVL）的存在：①免疫抑制剂的骤停可使复发（主要是分子生物学和细胞遗传学复发）病人再次进入缓解状态；②异基因造血干细胞移植复发率低于同基因造血干细胞移植；③发生急、慢性GVHD的病人复发率低于不发生GVHD的病人；④接受非去T细胞造血干细胞移植且无急、慢性GVHD发生的病人，移植后复发率仍低于同基因移植。这些资料不仅支持GVL效应，并且表明即使无GVHD发生，仍发生GVL效应。在不同疾病种类作用强度不同。如在AML和CML作用明显，但对ALL则作用较弱。而在多发性骨髓瘤中，GVL效应最弱［１７］。
7 排斥
虽然对HLA相合的脐血干细胞移植而言排斥并不构成临床的主要问题，但对于HLA不合的脐血干细胞移植，由于跨越的免疫屏障较大，且常采用去除供者T细胞的方式进行移植，排斥就转化为主要矛盾。排斥的机制一般认为是由于残留的受者T细胞识别供者抗原并发生免疫反应所致。供者T细胞由于可以抑制受者残存的T细胞而有促进植活之功能。近年对供者移植物中促进植活的不同细胞成份研究取得一定进展。动物模型表明，表达TCRαβ受体的细胞是促进植活的主体细胞。而表达TCRγδ的细胞具有促进细胞植活却不引起GVHD的功能，可用于HLA不合的移植。CD8+T细胞同样对促进植活起重要作用。进一步研究显示，其亚群Tc2是促进植活的主体细胞，且不引起严重GVHD［22~24］。
总之，异基因脐血造血干细胞移植是当今免疫治疗的热点，免疫耐受和免疫反应是其核心。随着对移植免疫反应的细胞分子机制的进一步深入研究，我们完全有可能在不远的将来建立全新的免疫耐受模式，在受惠于脐血干细胞移植带来的免疫治疗的益处的同时免受其合并症之苦，并最终跨越HLA不合的免疫屏障，将血液恶性肿瘤的治疗推向一个新的时代。
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