IL?6对NIH3T3细胞MMP?3和TIMP?1表达影响
作者：苏萌 邹云雯 褚言琛 杨堃
【摘要】 目的 探讨白细胞介素?6(IL?6)对小鼠NIH3T3成纤维细胞中基质金属蛋白酶?3(MMP?3)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP?1)表达的影响。方法 应用不同浓度(0、5、10、15、20 mg/L)的IL?6刺激NIH3T3成纤维细胞，共同培育12 h收集细胞。应用Western blot和 RT?PCR方法分别检测细胞内MMP?3和TIMP?1的表达。结果 MMP?3表达随着IL?6浓度的升高而上升，TIMP?1表达随着IL?6浓度的升高而下降。结论 IL?6能影响MMP?3和TIMP?1的表达平衡，可能是影响硬膜外瘢痕形成的机制之一。
【关键词】 白细胞介素6;瘢痕;基质溶解素1;金属蛋白酶1组织抑制剂
[ABSTRACT] Objective To study the affect of IL?6 on the expressions of MMP?3 and TIMP?1 in NIH3T3 fibroblasts in mice. Methods Different concentrations (0,5,10,15 and 20 mg/L) of IL?6 were applied to stimulate NIH3T3 fibroblasts and culture for 12 h and collect the cells. Western bolt and RT?PCR were employed to detect the expressions of MMP?3 and TIMP?1 within the cells. Results The expression of MMP?3 increased with the rising concentration of IL?6,and TIMP?1 declined. Conclusion IL?6 can affect the balance between the expressions of MMP?3 and TIMP?1, which is, probably, one of the mechanisms of epidural scar formation.
[KEY WORDS] interleukin?6; cicatrix; stromelysin 1; tissue inhibitor of metalloproteinase?1
大量研究表明，硬膜外瘢痕增生被认为是腰椎手术失败综合征(FBSS)的重要原因[1]。硬膜外瘢痕则是由于细胞外基质(ECM)的异常沉积所致。基质金属蛋白酶?3(MMP?3)能降解ECM，其活性受到金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP?1)的抑制，两者在瘢痕形成中起着重要的作用[2]。本研究应用炎症因子白细胞介素?6(IL?6)刺激小鼠NIH3T3成纤维细胞，观察其中MMP?3和TIMP?1表达的改变，从而探讨IL?6在瘢痕形成中的作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 小鼠NIH3T3成纤维细胞(购于中国科学院上海细胞库)。
1.1.2 试剂 IL?6(Sigma公司)，兔抗小鼠MMP?3单抗(Bioworld公司)，兔抗小鼠TIMP?1多抗(Bioworld公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗(Santa Cruz Biotechnology 公司)，TRIZOL、RT?PCR kit(TaKaRa公司)。
1.1.3 主要仪器 恒温培养箱(Thermo Forma，USA);倒置显微镜(Olympus,Japan); Western电泳仪;转膜仪(Bio?Rad，USA);PCR扩增仪(Eppendorf,Germeny);VILBER LOURMAT紫外线凝胶成像系统(France)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 细胞在37 ℃、体积分数为0.05 CO2的培养箱中培养，实验用第5～8代细胞，将细胞按照1×108/L接种于6孔培养板中，待细胞贴壁融合达到80%～90%时，换无血清的DMEM培养液继续培养18 h，然后加入不同质量浓度(0、5、10、15、20 μg/L)的IL?6刺激小鼠NIH3T3成纤维细胞12 h，收集细胞。
1.2.2 Western blot检测 细胞干预完毕后，加入细胞裂解液冰上裂解30 min，离心收集上清液，变性的蛋白样品经100 g/L分离胶电泳，恒流转膜至PVDF膜，封闭过夜，一抗分别用兔抗鼠MMP?3单抗和兔抗小鼠TIMP?1多抗，室温孵育60 min,二抗用HRP标记的羊抗兔抗体，室温孵育60 min, ECL发光剂作用后曝光显影。再用Striping buffer清除 PVDF膜上已结合的一抗和二抗，重新经β?Actin一抗、二抗孵育后，再次显像，作为内部参照。
1.2.3 RT?PCR 将收集到的细胞按照TaKaRa试剂说明书采用细胞总RNA TRIzol试剂提取RNA，用紫外线分光光度计和凝胶电泳检测其浓度和纯度。MMP?3上游引物序列：5′?GAGTGTGGA?TTCTGCCATTGAAA?3′，下游引物序列：5′?GCA?AAGGAGATCATTATGTCAGCC?3′;GAPDH的上游引物序列：5′?GCATTGTGGAAGGGCTCA?3′，下游引物序列：5′?GGGTAGGAACACGGAAGG?3′;TIMP?1上游引物序列:5′?CAGTAAGGCCTGTA?GCTGTGCC?3′，下游引物序列：5′?TGTAGGCGTACCGGATATCTGC?3′。反应条件：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s，扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。取扩增产物电泳后，溴化乙锭显色后分析。
1.3 统计学处理
对所得结果利用图像分析系统进行灰度分析，将目的条带吸光度值同相应内参进行比较，所得比值以±s表示，采用SPSS 11.0统计软件进行处理，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有显著性。
2 结 果
2.1 Western blot检测
在实验剂量范围内MMP?3的表达随着IL?6浓度的升高而升高，TIMP?1的表达随着IL?6浓度的升高而下降，差异具有统计学意义(F=186.049、2 145.536，q=2.812～118.686，P<0.05)。见图1、表1。
2.2 RT?PCR检测
以GAPDH为内参校正后，不同浓度的IL?6均上调MMP?3的表达和下调TIMP?1的表达，并且在实验剂量范围内MMP?3的表达随着IL?6浓度的加大而升高，TIMP?1的表达随着IL?6浓度的加大而下降，差异具有统计学意义(F=296.023、8 180.845，q=4.672～204.382，P<0.05)。见图2、表2。
3 讨 论
椎板切除术是脊柱外科最常采用的手术方式，用来治疗腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症和腰椎管内肿瘤等脊柱疾病。FBSS是椎板切除术后最常见的术后并发症之一，发病率平均为5%～10%[3]。硬脊膜周围纤维化和瘢痕形成被认为是导致FBSS表1 不同浓度IL?
6刺激小鼠NIH3T3成纤维细胞后MMP?3和TIMP?1蛋白表达表2 不同浓度IL?6刺激小鼠NIH3T3成纤维细胞后对MMP?3和TIMP?1 mRNA表达影响的重要的病理机制。SONGER等[4]于1990年提出了纤维化形成的三维立体学说，认为硬膜周围的纤维化既来自于后方损伤的骶脊肌，也来自前方的纤维环和后纵韧带，同时侧方的粘连也导致神经根受累,这一观点目前被大多数专家所接受和认可。目前临床最常用治疗措施是局部或全身应用类固醇激素，利用一些半流质或膜性物质作为物理或化学屏障隔断瘢痕与硬脊膜和神经根的接触，以此来预防硬膜外瘢痕形成;但通过动物实验以及长期临床观察结果显示，其不能有效预防硬膜外瘢痕的形成和FBSS的发生，而且需要延长手术时间和增加病人的失血量[5?6]。因此，利用细胞因子影响胶原的产生和代谢是防治病理性瘢痕的重要方法。瘢痕主要是由ECM大量沉积所致，ECM的主要成分是胶原，胶原蛋白的异常合成和沉积是导致局部纤维化和瘢痕形成的基础。MMPs是一组参与ECM降解的蛋白酶，其活性受到TIMPs的抑制。MMP?3能降解多种基质蛋白，包括蛋白多糖、纤维连接蛋白、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原，更为重要的是它能激活MMP?1,使其降解胶原的活性升高7～10倍，变为超活性基质金属蛋白酶(SA?MMP?1),并且还能激活MMP?7、MMP?8、MMP?9和MMP?10，从而降解胶原[7?8]。TIMPs是一组抑制MMPs活性的糖蛋白，有TIMP?1、TIMP?2、TIMP?3和TIMP4等4种类型[2]。TIMP?1 能高亲和性以1∶1结合到MMPs形成复合体，抑制MMP?1、MMP?2、MMP?3活性，促进胶原的沉积[9]。IL?6是一种多效能的内分泌调节因子，本实验结果显示IL?6能剂量依赖性上调MMP?3表达和下调TIMP?1的表达。胶原酶和MMP?3的低表达是增生性瘢痕组织内ECM过度沉积的重要原因[5]。有报道瘢痕成纤维细胞低表达MMP?3，通过基因转染技术将MMP?3的基因导入瘢痕成纤维细胞后，对ECM的降解力增强，说明MMP?3低表达是增生性瘢痕组织内ECM沉积的重要原因[10]。也有报道称在病理性瘢痕中，MMP?1和TIMP?1均高表达，但TIMP?1相对表达量更高[11]。一些研究结果表明,MMPs和TIMPs表达以及酶活性的异常与创面的不正常愈合有密切的关系，MMPs的表达明显升高会导致创面的不愈合,表达过低会导致瘢痕形成[12]，如何能在创面中平衡MMPs和TIMPs的表达将是预防和治疗瘢痕的重要手段。
本文实验结果提示，IL?6是能上调体外培养的NIH3T3细胞MMP?3的表达和抑制TIMP?1表达的细胞因子之一，这为我们进一步研究抗瘢痕形成机制和临床应用抗瘢痕药物提供了理论依据。但本实验仅是体外简单的细胞模型，并不能代表生理状况下人体内复杂的抗瘢痕形成机制，对于抗瘢痕形成的复杂机制还需要进一步研究。
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