瘦素对大鼠血管平滑肌舒缩功能的影响及其机制
【关键词】 主动脉【Abstract】 AIM: To investigate the effects of leptin on the contraction and relaxation of isolated thoracic aortic smooth muscle and its mechanism. METHODS: Isolated thoracic aorta was perfused and the tension of the vessel was measured. The activity of Na+K+ATPase of vascular smooth muscle cells (VSMC) was measured by biochemical method. RESULTS: ① Leptin promoted the vasoconstriction induced by noradrenaline and prolonged the relaxation duration of isolated thoracic aorta. ② Leptin inhibited the activity of Na+K+ATPase. ③ Wortmannin inhibited the above effects of leptin on VSMC. CONCLUSION: ① The effect of leptin on contraction and relaxation of isolated vascular smooth muscle may be related to the intracellular change of the activity of Na+K+ATPase. ② Leptin affects the activity of Na+K+ATPase by intracellular PI3K signal pathway.
【Keywords】 leptin; aorta, thoracic; Na+K+exchanging ATPase; PI3K; calcium
【摘要】 目的： 观察瘦素对离体血管平滑肌收缩和舒张功能的影响，并探讨其机制. 方法： 采用离体血管灌流试验，测定血管平滑肌的张力改变；贴块法培养血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC），生化定磷法测定细胞内Na+K+ATPase活性的改变. 结果： ① 瘦素对去甲肾上腺素（noradrenaline, NE）引起的血管平滑肌收缩有明显促进作用，且明显延长其舒张时间；② 瘦素抑制VSMC内Na+K+ATPase活性且有剂量和时间依赖性；③ PI3K抑制剂Wortmannin可抑制瘦素对VSMC的上述作用. 结论： ① 瘦素对血管平滑肌舒缩功能的影响与其抑制VSMC内Na+K+ATPase活性，使细胞内［Ca2+］i升高有关；② 瘦素对Na+K+ATPase活性的影响是经由受体后PI3K信号通路实现的.
【关键词】 瘦素；主动脉，胸；Na+K+交换ATP酶；PI3K；钙
0引言
瘦素是脂肪细胞分泌的由167个氨基酸组成的多肽,不仅调控摄食和能量代谢，还参与代谢紊乱综合征和心血管疾病的发病. 研究发现，原发性高血压患者的血压与血浆瘦素浓度相关，表明瘦素在肥胖相关性高血压的发病中起重要作用. 目前认为，高瘦素血症可通过激活交感神经系统、肾交感神经活性升高血压，并且还可通过影响组织细胞的离子代谢参与高血压的发病. Jerzy等［1］的研究认为，瘦素可降低正常大鼠肾髓质Na+K+ATPase活性. 在3T3L1纤维原细胞，瘦素也能抑制其Na+K+ATPase活性并且和作用浓度、作用时间有关［2］. Oda等［3］的研究证实，VSMC上不仅存在瘦素受体短型，瘦素还可促使VSMC的增殖和迁移. VSMC内Na+K+ATPase活性降低可导致细胞内Na+浓度升高，Na+/Ca2+交换增强而使细胞内［Ca2+］i增加. 从而抑制平滑肌的舒张. 因此， 研究瘦素对VSMC内Na+K+ATPase的作用有助于揭示肥胖相关性高血压的发病机制.
1材料和方法
1.1材料
SD大鼠40只，由西安交通大学实验动物中心提供,体质量170~180 g，雌雄不拘，随机分为对照组和瘦素处理组（n=20）. 鼠瘦素为美国R&D公司产品，渥曼青霉素（Wortmannin）为美国Alexis公司产品，ATPase检测试剂盒由南京建成生物工程研究所生产. XWT104型自动平衡记录仪由上海大华仪表厂制造，721分光光度计由上海第三分析仪器厂制造.
1.2方法
1.2.1大鼠离体胸主动脉平滑肌环的制备大鼠颈椎脱位处死后，迅速取胸主动脉. 置于pH 7.4改良台式液［成分(g/L)： NaCl 8.7, KCl 0.2, MgCl2 0.4, CaCl2 0.4, 葡萄糖1.0,三羟甲基氨基甲烷盐酸0.07］中，制备成3 mm长的动脉环，机械摩擦的方法去除内皮. 用银丝将血管环悬挂于37℃的恒温浴槽中，pH 7.4改良台式液灌流，溶液中通以950 mL/L O2. 用张力换能器将血管环的张力变化记录于记录仪上，基础张力定为9.8×10-3 N. 血管环平衡90 min后开始实验.
1.2.2离体血管舒缩能力的测定① 血管收缩张力的测定： 血管环平衡后，以终浓度为1 μmol/L的NE诱发其收缩反应，记录1, 2, 4, 6, 8, 10 min的张力和最大收缩张力. 对照组： 血管环不用瘦素处理；瘦素处理组： 血管环与1 μmol/L瘦素溶液共同温育30 min后，重复与对照组相同的步骤；② 血管舒张速度的测定： 血管环平衡后，以1 μmol/L的NE收缩至其最大收缩张力，改良台式液洗脱NE，记录1~12 min的血管张力对最大收缩张力的百分比，分组与处理同上.
1.2.3VSMC的培养按文献［4］方法培养VSMC. 取体质量在90~110 g的SD大鼠5只，处死后无菌条件下取胸腹主动脉. 贴块法行原代VSMC培养. DMEM培养基内含200 g/L胎牛血清，培养箱内温度37℃，充以50 mL/L的CO2，每周换液2~3次，细胞间完全融合后传代. 实验采用第4~6代细胞.
1.2.4VSMC内Na+K+ATPase活性测定的实验分组细胞传代至所需数量后，把所有培养瓶内的细胞消化转移至一瓶后计数，调整悬浮细胞的密度为1×109/L，按每管加入1 mL细胞悬液转移至5 mL离心管，分为4组： ① 对照组（n=5），不加入任何药物；② 不同浓度瘦素处理组，分4个亚组（n=5），分别用终浓度为0.9, 9, 90, 900 nmol/L的瘦素和细胞共同温育15 min；③ Wortmannin+瘦素处理组，以终浓度为100 nmol/L的Wortmannin与细胞共同温育20 min后，再分别用不同浓度的瘦素处理细胞15 min，瘦素浓度分组同②；④ 瘦素处理不同时间组，分5个亚组（n=5），用终浓度为100 nmol/L的瘦素分别与VSMC共同温育0, 5, 15, 30, 60 min，以0 min作为对照组. 上述干预前，细胞均在不含胎牛血清的DMEM培养基内饥饿2 h.
1.2.5VSMC内Na+K+ATPase的活性测定上述分组后的细胞悬液以2000 r/min离心10 min，弃上清液，留沉淀细胞，加5 mL生理盐水混匀，重新以2000 r/min离心10 min，弃上清液，将沉淀细胞加三蒸水至1 mL. 在漩涡混匀器上混匀30 s，放置15 min使其充分破碎. 取样200 μL按试剂盒操作说明书进行，721分光光度计660 nm处调零比色. 每一样本Na+K+ATPase活性均测平行管，求其平均值. 规定每小时每1×105个细胞的ATPase分解ATP产生1 μmol/L无机磷的量为一个ATPase活力单位.
统计学处理： 实验结果用x±s表示，组间比较采用重复测量的方差分析与完全随机设计的方差分析. P<0.05有显著性差异.
2结果
2.1瘦素对血管收缩和舒张功能的影响① 血管收缩张力的比较： 瘦素处理前后血管收缩张力有显著性差异（P<0.01, Fig 1）. 收缩张力在瘦素处理前后随时间变化的趋势不同（P<0.01），测量时间与处理因素存在交互作用（P<0.01）. 血管于10 min达到最大收缩张力，瘦素处理前后的最大收缩张力均值分别为（7.84±0.78）×10-3 N （0.80±0.08 g）和（8.31±0.88）×10-3 N（0.95±0.09 g）;② 血管舒张速度的比较： 瘦素处理前后血管舒张速度有显著性差异（P<0.01, Fig 2）. 瘦素处理前后舒张速度随时间变化的趋势不同（P<0.01），测量时间与处理因素存在交互作用（P<0.01）.
2.2VSMC的形态学观察及鉴定血管组织贴壁生长5~6 d后，可见VSMC从组织块边缘迁出. 细胞多层重叠贴壁生长呈高低起伏的“峰-谷”状，细胞呈梭形（Fig 3, 4）. 鼠抗人αactin免疫染色鉴定细胞纯度达到95%以上.2.3不同浓度瘦素对VSMC的Na+K+ATPase活性的影响及Wortmannin的阻断作用0.9 nmol/L leptin组与对照组间的Na+K+ATPase活性已有显著性差异（P<0.05），且其活性抑制程度与瘦素浓度正相关（r=0.877, P<0.01）. 与对照组相比，Wortmannin+瘦素组在9, 90, 900 nmol/L瘦素浓度时Na+K+ATPase活性有显著性降低（Fig 5）. 在9, 90, 900 nmol/L瘦素浓度时，瘦素组较Wortmannin+瘦素组Na+K+ATPase活性均有显著性降低.
2.4瘦素处理不同时间对VSMC内Na+K+ATPase活性的影响与对照组比较，瘦素处理5 min后，Na+K+ATPase活性即显著下降，为对照组的93.9%（P<0.05），随瘦素处理时间的延长，Na+K+ATPase活性抑制有时间依赖性. 至60 min时，Na+K+ATPase活性为对照组的57.1% （Fig 6）.
3讨论
通常认为，阻力血管VSMC内［Ca2+］i是决定血管平滑肌张力的一个重要因素,在原发性高血压的发生初期起关键性作用. 胰岛素可通过改变VSMC膜Na+K+ATPase的活性，影响Na+K+ATPase的基因表达来改变血管张力［5，6］. 但对作为瘦素胰岛素轴中的瘦素，目前主要研究其对VSMC的增殖作用，而瘦素对VSMC内Na+K+ATPase活性影响的报道很少.
研究认为，瘦素受体短型分布于全身各组织. 国内有人［7］发现，SHR大鼠VSMC上有OBRb（瘦素受体长型）的表达，Oda等［3］的研究认为大鼠VSMC有瘦素受体短型的表达，为该实验提供了理论依据. Jerzy等［1］证实了瘦素对多种组织细胞Na+K+ATPase活性的影响. 因此，我们假设瘦素可抑制VSMC内Na+K+ATPase活性，参与高血压的发病. 本实验结果显示，瘦素处理后血管收缩张力随时间变化的趋势增大，血管环舒张速度显著减慢，VSMC内Na+K+ATPase活性受到抑制且表现为剂量和时间依赖性. 表明瘦素可直接抑制VSMC内Na+K+ATPase活性，Na+Ca2+交换活性增强，使胞内处于高［Ca2+］i状态，从而使血管收缩张力增大，舒张速度减慢.
目前已知瘦素受体后的信号通路包括JAK/STAT, MAPK/ERK, PI3K通路. 在3T3L1纤维原细胞，瘦素部分通过受体后PI3K信号通路抑制Na+K+ATPase活性. 而PI3K同样参与VSMC的Na+K+ATPase活性调控［8］. 实验中我们观察到用100 nmol/L的Wortmannin（PI3K抑制剂）预处理细胞20 min后，Wortmannin+瘦素组较瘦素组VSMC内Na+K+ATPase活性有显著性升高（P<0.01）. 说明Wortmannin可通过抑制瘦素受体后PI3K信号通路干预瘦素的作用，从而影响VSMC内Na+K+ATPase活性，但在瘦素浓度较高时，Wortmannin的阻断作用有限. Wortmannin并未能完全使Na+K+ATPase活性恢复正常，说明除PI3K信号通路，可能还有其他受体后通路影响Na+K+ATPase活性.
据此，我们认为，肥胖所致的高瘦素血症不仅可通过增加交感神经活性促使血管平滑肌收缩，还可通过直接抑制VSMC内Na+K+ATPase活性，引起血管张力的改变，参与高血压的发生.
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