胃肠舒对大鼠胃肠平滑肌细胞钙离子浓度的影响
作者：宋晓冬 杨成 刘孟安 孙丰润 刘颖 张丽霞 刘文波
【摘要】 目的 通过测定体外培养的SD大鼠胃肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度，观察胃肠舒对SD大鼠胃肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度的影响，探讨胃肠舒促胃肠动力的作用机制。方法 离体培养SD大鼠胃肠平滑肌细胞，应用特异性Ca2+荧光探针Fura-2AM负载细胞，激光共聚焦显微镜检测游离Ca2+浓度。结果 胃肠舒在25、50、100 mg/ml 时均可升高胃肠平滑肌游离Ca2+浓度，且随剂量增加而加强。结论 胃肠舒具有升高胃肠平滑肌细胞游离Ca2＋的作用，Ca2+作为细胞内第二信使可能参与了胃肠舒促进胃肠平滑肌细胞的动力机制。
【关键词】 胃肠舒；胃肠平滑肌细胞；Ca2+浓度 ；Fura-2AM；激光共聚焦显微镜
【Abstract】 Objective To observe Weichangshu on free Ca2+ concentration in gastrointestinal smooth muscle cell and explore its mechanism through determining free ［Ca2+］i concentration in rat gastrointestinal smooth muscle cell.Methods SD rat gastrointestinal smooth muscle cells were cultured and loaded with Fura-2AM.［Ca2+］i was measured by fluorescent intensity in each group cell with laser scanning confocal microscope. Results 25, 50, 100 mg/ml Weichangshu could elevate ［Ca２＋］i in gastrointestinal smooth muscle. The level of ［Ca２＋］i acted in dose-dependent. Conclusion The data indicated Weichangshu could increase ［Ca２＋］i in gastrointestinal smooth muscle cells. Ca２＋ as an intracellular second messenger, might be involved in the mechanism by which Weichangshu promoted the motility of gastrointestinal smooth muscle cells.
【Key words】 Weichangshu,gastrointestinal smooth muscle cells,［Ca２＋］i,Fura-2AM,laser scanning confocal microscope
胃肠运动障碍型疾病是临床多发病，多与胃肠蠕动功能减弱有关，是一类无法用解剖结构异常来解释的临床疾病，其主要病理生理基础为胃排空延迟及小肠传输功能障碍［１,２］，现临床最常用的促胃肠动力药促进胃肠蠕动虽然有较好疗效，但其副作用如药理作用受限、催乳素增加、焦虑、激动、运动性不安、共济失调、腹泻、腹痛等不可忽视。目前胃肠运动障碍型疾病由于发病机制尚不清楚［3,4］，其药物的研发受到限制，因此研究该类疾病的调控机制，为开发中药新药提供科学的数据非常重要［5］。
胃肠舒是本课题组研究人员根据《伤寒论》大承气汤、小承气汤、调胃承气汤三方化裁，取大黄、枳壳、甘草组方，经临床反复药物筛选研制而成的纯中药制剂，可起到有效促进胃肠动力的作用［6,7］。本研究选取SD大鼠胃肠组织进行原代细胞培养，构建胃肠平滑肌细胞模型，不同浓度的胃肠舒作用后，测定用药后胃肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度的变化，初步探讨了胃肠舒促进胃肠动力的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料 胃肠舒由滨州医学院附属医院制剂室提供；西沙必利由浙江京新药业股份有限公司生产；标准SD大白鼠由烟台绿叶实验动物中心提供；DMEM培养基购自GiBco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司；Fura-2AM Ca2+荧光探针购自碧云天生物技术研究所；牛血清白蛋白购自碧云天生物技术研究所；HERA CO2培养箱；TCS SPE 激光扫描共聚焦显微镜。
1.2 方法
1.2.1 离体胃肠平滑肌细胞的培养：选择标准SD大白鼠，体质量180～200 g，雌雄各半，乙醚麻醉，剖腹后迅速剪取胃体、空肠组织，PBS清洗后剪碎，去除上清液，重复清洗2～3次。将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液，加入0.25％胰蛋白酶，在4 ℃孵育6～18 h。移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37 ℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30 min。待小块组织完全消化溶解后，过200目网，1 000 r/min离心7 min。弃上清液，向细胞沉淀中加入新鲜配制含20%胎牛血清的DMEM培养液，轻轻吹打，后按每瓶(25 ml)3×104活细胞接种在培养瓶里，放入37°C孵箱里静置培养待测，CK×41倒置相差显微镜观察拍照。
1.2.2 平滑肌细胞的鉴定：将处理好的盖玻片，放入6孔板使之与孔底贴合紧密，进行细胞培养。细胞生长至第5代吸去培养液，先用PBS洗涤已贴壁盖玻片2～3次。95%酒精室温固定20 min，PBS洗2～3次。0.1% TritonX-100室温孵育20～30 min增强细胞通透性。正常羊血清于37℃封闭20 min。滴加一抗兔抗鼠α-actin单克隆抗体（1∶200，购自Sigma公司）室温过夜，滴加二抗羊抗兔FITC-IgG（1∶100），37 ℃孵育2 h，倒置荧光显微镜（波长500 nm）观察拍照。
1.2.3 胞内钙离子浓度测定：实验分为5组，分别为空白对照组、西沙必利对照组（0.51 mg/ml）、胃肠舒小剂量组Ⅰ组（25 mg/ml）、胃肠舒中剂量组Ⅱ组（50 mg/ml）、胃肠舒大剂量组Ⅲ组（100 mg/ml）。D-Hanks液吹打6孔板中培养的胃肠平滑肌细胞，用移液枪吸取1 ml细胞悬液于1.5 ml离心管中进行Fura-2AM荧光探针的负载。胞内钙离子测定方法参考文献［7］方法，稍有改进。将细胞悬液常温离心洗涤950 r/min×5 min×3次，弃上清液。避光加入50 μl浓度为10 μmol/L（使用浓度）的Fura-2AM，37℃避光孵育负载细胞40～50 min，轻轻摇动，以加速Fura-2AM进入细胞内，实验过程中注意用铝箔包严。950 r/min离心5 min终止孵育，弃上清液。在沉淀中加入D-Hanks液，离心洗涤950 r/min×5 min×3次，洗去胞外残存的Fura-2AM，弃上清液。D-Hanks液吹打为细胞悬液进行激光扫描共聚焦显微镜检测。检测之前，吸取少量细胞悬液，滴片，加盖盖玻片。激光共聚焦显微镜下立即扫描检测（激发波长为340 nm，发射波长为510 nm）。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，胃肠舒各浓度组与空白对照组及西沙必利对照组间比较用方差分析，各组间两两比较。
2 结果
2.1 胃肠平滑肌细胞的原代培养及其鉴定 倒置显微镜下观察可见细胞形状椭圆形，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状，峰处为多层细胞，谷处为单层或双层细胞，培养4 d后细胞铺满培养瓶瓶底。为确定胃肠平滑肌细胞离体分离培养成功，用兔抗鼠а-actin mAb单克隆抗体进行了鉴定，细胞经漂洗后置于荧光显微镜下观察，负载了FITC的细胞经500 nm的波长激发下产生荧光，可见95% 以上的细胞显示了阳性荧光标记，说明离体培养的平滑肌细胞成功。
图1 胃肠平滑肌细胞的鉴定×400
2.2 激光共聚焦显微镜检测胃肠舒对胃肠平滑肌细胞内Ca2+的影响
2.2.1 各组胃肠平滑肌细胞内Ca2+荧光强度值比较：测定各药物组选定细胞的荧光强度值，计算均数±标准差（x±s），即为该药物浓度细胞的平均荧光强度。对胃肠平滑肌细胞各药物组中细胞内Ca2+荧光强度两两比较：胃肠舒片各浓度组与空白对照组相比，均存在极显著差异(P＜0.01)，即胃肠舒片能明显升高胃肠平滑肌细胞内Ca2+浓度（表1）。胃肠舒片各浓度组与西沙必利对照组比较：胃肠舒25 mg/ml组与西沙必利0.51 mg/ml组差异不显著(P＞0.05)，即两者在升高平滑肌胞内Ca2+浓度方面效果相当。胃肠舒片50 mg/ml组与西沙必利0.51 mg/ml组差异显著(P＜0.05)，即胃肠舒片50 mg/ml组在升高平滑肌胞内Ca2+浓度方面，效果优于西沙必利0.51 mg/ml组。胃肠舒100 mg/ml组与西沙必利0.51 mg/ml组相比，存在极显著差异(P＜0.01)，胃肠舒100 mg/ml组在升高平滑肌胞内Ca2+浓度方面效果明显优于西沙必利0.51 mg/ml组（表1）。表1 胃肠舒组与对照组细胞荧光强度值比较与空白对照组比较*P＜0.01, 与西沙必利组比较△P＜0.05
2.2.2 激光共聚焦显微镜拍摄各组胃肠平滑肌细胞内Ca2+荧光强度图：图2是在激光共聚焦显微镜下观察到的胃肠舒对胃肠平滑肌细胞的影响，图中照片明显显示胃肠舒组胃肠平滑肌细胞的Ca2+流高于空白对照组和西沙必利组，且随着胃肠舒用药浓度的增加对Ca2+流的影响越大。
3 讨论
胃肠动力障碍疾病是常见的消化系统疾病之一，在世界范围内发病率较高，且有日渐上升趋势。目前认为，胃肠动力障碍性疾病的发生可能不仅与中枢神经系统、自主神经系统有关，还可能与离子浓度、离子通道等有关，因此，对该病发病机制中离子浓度和离子通道的变化研究十分重要。
目前已知离子通道的信号传递是细胞外信号调控胃肠道平滑肌细胞活动的一个重要途径， 有赖于Ca2+、Na+、K+、Cl-等多种离子的存在［8～14］， 其中 Ca2+是胃肠平滑肌的兴奋-收缩耦联者，当胞质内 Ca2+ 浓度至一定水平时，即使没有膜电位变化，也可触发胃肠平滑肌收缩。L 型 Ca2+通道是 Ca2+进入胃肠细胞的主要通道， 应用调控离子通道类药物将是今后治疗胃肠动力类药的新方向。胃肠道神经系统中最主要的兴奋性神经递质是乙酰胆碱（ACh），可以与毒蕈碱的 M2 型受体结合。副交感神经节后纤维释放 Ach 作用于平滑肌 M受体后可开放质膜上 L型 Ca2+通道, 产生内流致肌收缩［15～18］。
胃肠平滑肌细胞胞浆游离Ca2+在平滑肌细胞收缩与舒张过程中起重要的“第二信使”作用。一般认为，平滑肌收缩和舒张活动与胞内钙离子浓度变化密切相关：高浓度Ca2+引起平滑肌收缩,低浓度Ca2+引起平滑肌舒张。应用Ca2+敏感的荧光探针Quin-2、Fura-2、Indo-l 及Fluo-3 测定显示平滑肌细胞静息时胞内Ca2+ 浓度为120～270 nmol/ L ，激活时可达500～700 nmol/ L。肌细胞膜系统在维持细胞内外Ca2+ 正常浓度中起重要作用,通过质膜和肌质网膜的移动调节胞内Ca2+浓度。平滑肌收缩时的钙离子来源于细胞外Ca2+内流或细胞内钙库Ca2+释放(主要是肌质网)。生理条件下,胞外Ca2+可通过质膜钙离子通道进入细胞；肌质网贮存Ca2+，也可通过IP相关通道或通过Ca2+诱发的Ca2+释放进入胞浆。平滑肌细胞外Ca2+内流和细胞内贮存Ca2+释放相互影响,细胞外Ca2+通过L 型钙离子通道内流可诱发钙离子诱导的钙离子释放(CICR)，相反，细胞内贮存Ca2+减少亦可引发细胞外Ca2+进入细胞(CRAC)。CRAC 多通过非选择性离子通道，且不被 L型钙离子通道拮抗剂拮抗［19，20］。
本实验通过选取SD大鼠胃肠平滑肌细胞的原代培养，不同浓度药物作用后，荧光探针Fura-2AM标记培养大鼠胃平滑肌细胞内的游离Ca2+ ，通过激光共聚焦显微镜检测到了胃肠平滑肌细胞荧光强度值：胃肠舒片100 mg/ml组：胃134.543±15.328、肠157.173±18.270；胃肠舒片50 mg/ml组：胃 68.585±6.299、肠 89.703±24.945；胃肠舒片25 mg/ml组：胃 51.125±20.358、肠58.455±8.781；西沙必利0.51 mg/ml：胃 48.963±7.871、肠 49.825±14.063；空白对照组：胃18.350±6.528、肠 28.150±4.213，从荧光强度值显示胃肠舒组与空白对照组相比，能明显提高胃肠平滑肌细胞内Ca2+ 的浓度，并且效果优于西沙必利组，推测Ca2+浓度的增高可能参与了胃肠舒促胃肠动力的作用。
【参考文献】
［1］ Aoki S, Haruma K, Kusunoki H,et al. Evaluation of gastric emptying measured with the 13C-octanoic acid breath test in patients with functional dyspepsia: comparison with ultrasonography［Ｊ］. Scand J Gastroenterol,2002,37: 662-666.
［2］ Tack J, Bisschops R, Demarchi B. Causes and treatment of functional dyspepsia［J］.Curr Gastroenterol Rep，2001，3: 503-508.
［3］ Ladabaum U, Minoshima S, Hasler WL,et al. Gastric distention correlates with activation of multiple cortical and subcortical regions［J］.Gastroenterology，2001，120:369-376.
［4］ Riezzo G, Chiloiro M, Russo F,et al. Gastric electrical activity and gastrointestinal hormones in dyspeptic patients［J］. Digestion，2001，63:20-29.
［5］ 岳茂兴. 胃肠道功能障碍及衰竭的诊断和治疗［Ｊ］. 世界华人消化杂志，2002,10(1): 3-6.
［6］ 宋晓冬，刘孟安，孙丰润，等.胃肠舒片对大白鼠胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响［Ｊ］.滨州医学院学报，2007，30（5）：321-324.
［7］ 宋晓冬，刘孟安，孙丰润，等.中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞ATP生成的影响［J］.世界华人消化杂志,2007,15（30）：1715-1719.
［8］ Nakajima H, Goto H, Azuma YT, et al. Functional interactions between the SK2 channel and the nicotinic acetylcholine receptor in enteric neurons of the guinea pig ileum［J］. J Neurochem,2007,103(6):2428-2438.
［9］ Sitmo M, Rehn M, Diener M. Stimulation of voltage-dependent Ca2+ channels by NO at rat myenteric neurons［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,293(4):G886-893.
［10］ Nakayama S, Kajioka S, Goto K,et al. Calcium-associated mechanisms in gut pacemaker activity［J］. J Cell Mol Med,2007,11(5):958-968.
［11］ Wu WK, Li GR, Wong TM,et al. Involvement of voltage-gated K(+) and Na (+) channels in gastric epithelial cell migration［Ｊ］. Mol Cell Biochem,2007,19(4-5):187-198.
［12］ Freeman LC, Narvaez DF, McCoy A, et al. Depolarization and decreased surface expression of K+ channels contribute to NSAID-inhibition of intestinal restitution［J］. Biochem Pharmacol,2007,74(1):74-85.
［13］ Kraichely RE, Farrugia G. Mechanosensitive ion channels in interstitial cells of Cajal and smooth muscle of the gastrointestinal tract［Ｊ］. Neurogastroenterol Motil,2007,19(4):245-252.
［１４］ Choi S, Yeum CH, Chang IY,et al. Activating of ATP-dependent K+ channels comprised of K(ir) 6.2 and SUR 2B by PGE2 through EP2 receptor in cultured interstitial cells of Cajal from murine small intestine［Ｊ］.Cell Physiol Biochem,2006,18(4-5):187-198.
［15］ Kovac JR, Chrones T, Sims SM.Temporal and spatial dynamics underlying capacitative calcium entry in human colonic smooth muscle［Ｊ］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,75(2):74-85.
［16］ Kang D, Hur CG, Park JY,et al. Acetylcholine increases Ca2+ influx by activation of CaMKII in mouse oocytes［J］. Biochem Biophys Res Commun，2007，360(2):476-482.
［17］ Fagundes DS, Grasa L, Arruebo MP,et al. Ca2+-activated K+ channels involved in duodenal dismotility induced by ethanol［Ｊ］.Alcohol,2007,42(4):291-295.
［１８］ Chung WS, Farley JM. Tachyphylaxis to the inhibitory effect of L-type channel blockers on ACh-induced ［Ca2+］i oscillations in porcine tracheal myocytes［Ｊ］. J Biomed Sci,2007,14(1):129-143.
［19］ Callaghan B, Zhong J, Keef KD. Signaling pathway underlying stimulation of L-type Ca2+ channels in rabbit portal vein myocytes by recombinant Gbetagamma subunits［Ｊ］. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(5): H2541-2546.
［20］ Kawada T, Yamazaki T, Akiyama T,et al. Effects of Ca2+channel antagonists on nerve stimulation-induced and ischemia-induced myocardial interstitial acetylcholine release in cats［Ｊ］. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(5):H2187-2191.
【胃肠舒对大鼠胃肠平滑肌细胞钙离子浓度的影响】相关文章：
中药胃肠舒片防治肠粘连的实验研究11-16
atRA对动脉内皮损伤后平滑肌细胞CDKs表达影响03-29
免疫调节胃肠的脂肪乳剂11-16
胃肠镜室临床护理带教中存在的问题及对策12-09
次声作用对大鼠视觉电生理功能的影响12-10
- 相关推荐