大鼠脑干DVC区注射ghrelin对弓状核NPY mRNA及AgRP mRNA表达的影
作者：陈新科 李清春 陈曦 蒋正尧 管洪在【摘要】 目的 探讨脑干迷走神经复合体(DVC)区微量注射ghrelin对摄食的影响及其可能机制。方法 72只雄性SD大鼠随机分成给药组和正常对照组，每组36只大鼠，行DVC区埋管手术，术后恢复7 d。7 d后给药组大鼠DVC区微量注射20 pmol的ghrelin，正常对照组大鼠DVC区微量注射等体积生理盐水。两组分别于给药后1、2、3 h取大鼠下丘脑提取RNA，应用荧光定量PCR方法检测大鼠下丘脑弓状核神经肽Y（NPY）及刺鼠色蛋白相关蛋白（AgRP）mRNA的表达情况。结果 给药组大鼠给药后1、2、3 h下丘脑NPY mRNA和AgRP mRNA的表达水平均明显高于正常对照组，差异有显著性（t=2.79～9.12，P<0.05）。给药组大鼠给药后2 h下丘脑NPY mRNA和AgRP mRNA的表达水平明显高于给药后1 h及3 h组（F=16.55、10.45，q=3.89～4.45,P<0.05)，但给药后1 h与3 h下丘脑NPY mRNA和AgRP mRNA的表达水平比较差异无显著性(P>0.05)。结论 作用于大鼠DVC区的ghrelin可能通过下丘脑弓状核NPY、AgRP神经通路促进摄食活动。
【关键词】 Ghrelin；下丘脑；弓状核；神经肽Y；刺鼠色蛋白相关蛋白；大鼠
hrelin是生长素促分泌素受体（GHS?R）的内源性配体，由28个氨基酸组成，在饮食的控制中发挥着重要的作用。已有研究表明，外周和脑室注射ghrelin都可使摄食量明显增加。尽管GHS?R分布在脑中枢的多个区域,但目前绝大多数研究认为，无论中枢还是外周ghrelin促进摄食作用都是通过下丘脑弓状核神经肽Y（NPY）、 刺鼠色蛋白相关蛋白（AgRP）神经元上的GSH?R介导的[1]。KIMBERL等[2]在大鼠第三脑室和第四脑室注射ghrelin后明显地增加了下丘脑弓状核NPY的表达，但是第三脑室和第四脑室相互交通，注射在任何一个脑室的药物均有可能弥散到另一个脑室，从而影响结果的分析。最近ZIGMAN等[3]用原位杂交法的研究结果表明，在大鼠迷走神经复合体（DVC）区的3个组成部分：孤束核、迷走神经运动背核和最后区均有GHS?R的表达。FAUL?CONBRIDGE等[4]在大鼠右侧DVC区注射10 pmol ghrelin获得相当于下丘脑弓状核注射30 pmol的摄食增加反应，提示在中枢ghrelin诱发的多食反应中，DVC可能和下丘脑弓状核同样重要。本文采用荧光定量PCR的方法检测大鼠DVC区微量注射ghrelin 后下丘脑NPY mRNA及AgRP mRNA表达的变化，进而探讨脑干DVC区微量注射ghrelin促进摄食的可能机制。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物与分组
健康成年雄性SD大鼠72只，体质量250～350 g，由山东中医药大学实验动物中心提供。随机分成给药组和正常对照组，每组又根据注射后检测间隔时间的不同分为3个亚组，即1 h组、2 h组和3 h组，每个亚组12只大鼠。给药组大鼠DVC区埋管后微量注射20 pmol ghrelin，正常对照组DVC区以相同方法埋置套管，微量注射等体积生理盐水。
1.2 主要试剂与仪器
Ghrelin 购自美国肽公司（American Peptide Company, INC），生理盐水溶解。TRIzol 购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自MBI公司。 SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自TOYOBO公司。荧光定量PCR仪为ABI 7500。立体定位仪为日本Narishige公司生产。紫外线分光光度计为Eppendorf Biophotometer公司生产。引物由上海生工合成，序列如下：内参照β?actin 上游引物5′?CCATCCAGGCTGTGTTGTCC?3′，下游引物5′?GCTTCTCTTTAATGTCACGCACG?3′；PCR产物长度为243 bp。NPY 上游引物5′?TGTGGACTG?ACCCTCGCTCTAT?3′，下游引物5′?TGTAGTGT?CGCAGAGCGGAGTA?3′；PCR产物长度为139 bp。AgRP上游引物5′?AGCTTTGGCAGAGGTGCTA?GATC?3′，下游引物5′?TGCCAGTACCTAGCTTGCGG?3′；PCR产物长度为173 bp。
1.3 实验方法
1.3.1 DVC区埋置套管 SD大鼠在(22±1)℃室温下，保持12 h白天、12 h黑夜循环的环境下饲养，自由饮水和进食。手术当天，大鼠用80 g/L水合氯醛(400 mg／kg)腹腔麻醉，俯卧位，固定在立体定位仪上，头部正中切口，剥离骨膜，使前后囟位于同一水平面。用三棱针在颅骨表面钻孔，清除脑膜，参照大鼠脑图谱[5]，将长15 mm、内径0.3 mm、外径0.4 mm的自制不锈钢套管垂直置入右侧DVC区(前囟后13.8 mm，正中线旁开0.4 mm，颅骨表面下8.5 mm)，将一小螺丝钉固定于颅骨表面，用502胶和自凝牙托粉固定套管，并置入不锈钢内芯防止阻塞[6]。
1.3.2 埋管位置鉴定 分组实验前先行埋管位置准确性的鉴定。大鼠手术后恢复7 d，分笼饲养，每天腹腔注射2万单位青霉素预防感染。经套管微量注射0.2 μL 滂胺天蓝，然后心脏灌流生理盐水和40 g/L甲醛后，取脑，以40 g/L 蔗糖?甲醛溶液固定，50 μm冠状冷冻切片，观察DVC置管定位准确性。重复此实验，直至连续8只大鼠均能准确定位。
1.3.3 RNA的提取 大鼠手术后恢复7 d，给药组大鼠微量注射20 pmol ghrelin，2 min内注完，留针10 min；正常对照组同样方法给予等体积生理盐水。给药和测定均在每天的上午10：00开始，实验前3 d即开始模拟注射操作，以减少应激反应。所有动物均自由摄食。给药后1、2、3 h分别取大鼠下丘脑，用Trizol Reagent常规方法提取总RNA，Eppendorf紫外线分光光度计测定RNA浓度和纯度，并进行8 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察RNA完整性。
1.3.4 cDNA合成和荧光定量PCR反应 取5 μg总RNA，以Oligo dT为引物，按试剂盒说明书进行逆转录反应得到cDNA备用。定量PCR前将样品稀释1 000倍，反应体系为25 μL，含cDNA 2.5 μL,SYBR Green Mix 12.5 μL,10 μmol/L 上下游引物各1 μL,RNase?free Water 8 μL。反应条件：95 ℃60 s预变性；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s共40个循环。
1.3.5 荧光定量PCR结果的计算 △△ct=（目的ct值-内参照ct值）-（目的ct值校正数-内参照ct值校正数），然后取2-△△ct作为样品初始cDNA的相对量。ct值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
1.4 统计学分析
采用PPMS 1.5[7]统计软件进行数据处理，数据以±s表示，数据间比较采用方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
给药组和正常对照组大鼠下丘脑中均检出了NPY mRNA、AgRP mRNA及内参照基因的表达(图1)。熔解曲线分析可见单峰值，排除了非特异性扩增(图2)。给药组大鼠给药后1、2、3 h下丘脑NPY mRNA及AgRP mRNA的表达水平均明显高于正常对照组（t=2.79～9.12，P<0.05）。给药组大鼠给药后2 h下丘脑NPY mRNA及AgRP mRNA的表达水平明显高于给药后1 h及3 h(F=16.55、10.45，q=3.89～4.45,P<0.05)，给药后1 h与3 h下丘脑NPY mRNA及AgRP mRNA表达水平比较，差异无差异性(P>0.05)。见表1。 图1 β?actin及NPY、AgRP的荧光定量PCR产物电泳图（略）
M为DNA Maker；①、②实验组NPY；③对照组NPY；④对照组AgRP；⑤⑥实验组AgRP；⑦阴性对照
图2 熔解曲线图（略）
表1 DVC 区注射ghrelin后不同时间大鼠下丘脑NPY mRNA和AgRP mRNA表达比较（略）
与正常对照组比较，*t=2.79～9.12,P<0.05；与其他时间点比较，F=16.55、10.45，#q=3.89～4.45,P<0.05
3 讨论
Ghrelin是由胃黏膜内分泌X/A样细胞释放的GSH?R的内源性配体，其第3位的丝氨酸被辛酰化,这一修饰是其发挥活性所必需的。除了可促进生长素释放，ghrelin 还具有促进食欲，增加体质量，参与体质量和能量稳态的长期调节等作用[8]。它是迄今所发现的在禁食状态下分泌增多的胃肠激素，即在饥饿和餐前有一个分泌峰，而进食后血浆ghrelin水平下降, 携带一种“反映胃营养充载状态的信息”传入脑中枢调节能量代谢[9,10]，被称为“摄食启动因子或饥饿激素”。对ghrelin的研究有着重要的意义，它是第一个被发现的促进食欲、减少脂肪利用的全身性循环激素，和参与肥胖调控的leptin作用相反，且参与体质量和能量稳态的长期调节，是减肥瘦身药物开发的作用靶点；ghrelin受体激动剂可用于治疗神经性厌食，研究ghrelin调节摄食的神经内分泌机制，可为防治肥胖提供有价值的资料。
绝大多数研究结果证实，ghrelin刺激摄食的作用靶点是下丘脑弓状核NPY、AgRP神经元[1]，这是ghrelin诱发多食反应的前脑机制，因为大约90%的NPY、AgRP神经元表达GHS?R[11]。已有实验证实，脑室或腹腔注射ghrelin均引起下丘脑弓状核c?Fos和NPY mRNA、AgRP mRNA表达增加,ghrelin所诱导的饮食促进作用可以被抗NPY、AgRP抗体或NPY Y1受体拮抗剂所阻断。低剂量ghrelin 弓状核区注射可以很明显地增加大鼠摄食量。近年来，ghrelin其他潜在作用位点的研究成为关注的焦点。已经证实迷走神经切除的大鼠ghre?lin的摄食促进效应消失，表明ghrelin可以通过作用于迷走神经传入神经纤维发挥作用。DVC是腹腔胃肠道机械和化学信息的传入中枢的第一个换元站，迷走?迷走反射在此整合。下丘脑弓状核AgRP神经元和室旁核有双向联系，而DVC的上行纤维经臂旁核终止于室旁核。DVC包括孤束核、迷走神经运动背核和最后区。孤束核和最后区不但接受腹部迷走神经的传入，而且最后区属位于第四脑室底部的室周器官，其毛细血管有很多窗孔，血?脑脊液屏障不完整，和弓状核一样是感受循环血液中ghrelin的理想部位。有充分理由认为，DVC是ghrelin诱发多食反应的作用靶点。
本实验结果显示，在SD大鼠DVC区微量注射20 pmol ghrelin后1、2、3 h，下丘脑NPY mRNA、AgRP mRNA的表达均明显增加，表明DVC区与下丘脑NPY/AgRP神经元通路是密切相关的。此外，本实验结果还显示，DVC区注射ghrelin后1 h发挥作用，在2 h左右达到最高峰，此后其作用渐渐消退。表明ghrelin诱发多食反应可能有两条途径：第一条是目前比较公认的“前脑机制”, 即ghrelin作用于下丘脑弓状核NPY/AgRP 神经元的 GHS?R； 第二条是ghrelin作用于脑干DVC的GHS?R，然后通过上行纤维引起下丘脑NPY mRNA 及AgRP mRNA的表达增加，且两条途径可以协同作用引起多食反应。
【参考文献】
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