番木瓜eIF4E和eIFiso4E的克隆及其与PRSV-VPg互作研究

番木瓜eIF4E和eIFiso4E的克隆及其与PRSV-VPg互作研究

　　论文摘要: 番木瓜环斑病毒(Papaya Ringspot Virus, PRSV)属于马铃薯Y病毒属(Potyvir（略）是制约番木瓜种植业和加工产业的主要因素.在马铃薯Y病毒基因组5’端（略）因组连接蛋白(virus genome-linked protein, VPg), VPg可在病毒的感染周期中干预几个步骤,包括病毒RNA的复制,病毒细胞间移动和长距离移动.真核翻译起始因子4E (eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E)能够与mRNA的帽子结构或帽子同系物特异地交（略）白质合成的起始中起关键作用.通常情况下,mRNA是通过5’帽子结构与eIF4E结合,但马铃薯Y病毒属病毒基因组的5’端没有帽子结构,而是共价结合VPg蛋白.研究发现,病毒基因组连（略）与eIF4E的结合在多种马铃薯Y病毒属病毒侵染植物过程中起关键作用,通过突变eIF4E的关键位点能影响病毒-植物的互作,并能介导植物对病毒的抗性.eIF4E是一个多（略）植物中eIF4E家族成员包括eIF4E及其异构体eIFiso4E,这两个因子在翻译起始过程的作用...

　　The potyvirus papaya ringspot virus (PRSV) is an important pathogen that restricts papay（omitted）ion and cucurbits production. At the 5end of the potyvirus genome, there is a viral（omitted）inked to the genome (VPg) which m（omitted）ne at several steps in the virus infection cycle, including viral RNA replication, and viral cell-to-cell and long-distance movement.（omitted）otic translation initiation factor 4（omitted）n bind with m7GpppN cap structure of mRNA or cap homologue specifically play impor...

　　目录:摘要 第4-6页

　　Abstract 第6-7页

　　目录 第8-12页

　　1. 引言 第12-27页

　　·番木瓜环斑病毒概述 第13-16页

　　·症状表现 第13页

　　·PRSV株系、寄主范围和传播途径 第13-14页

　　·马铃薯Y病毒属基因组结构和功能研究 第14页

　　·番木瓜抗PRSV基因工程研究 第14-16页

　　·真核翻译起始因子4E的结构、功能和调节 第16-17页

　　·真核翻译起始因子4E的结构 第16页

　　·真核翻译起始因子4E的功能 第16页

　　·真核翻译起始因子4E的调节 第16-17页

　　·植物真核翻译起始因子4E的研究进展 第17-22页

　　·真核翻译起始因子4E与蛋白质翻译起始 第17-18页

　　·eIF4E参与马铃薯Y病毒繁殖的可能机制 第18-19页

　　·马铃薯Y病毒可选择性地利用eIF4E基因家族的成员 第19-20页

　　·植物eIF4E与病毒互作的研究 第20页

　　·eIF4E在植物抗病上的研究 第20-22页

　　·本文研究蛋白质相互作用的方法 第22-24页

　　·细胞核酵母双杂交 第22-23页

　　·双分子荧光互补技术 第23-24页

　　·本研究的目的意义和技术路线 第24-27页

　　·目的意义 第24-26页

　　·技术路线 第26-27页

　　2 材料与方法 第27-51页

　　·材料与试剂 第27-33页

　　·植物材料 第27页

　　·主要的酶和生化试剂 第27页

　　·菌株和质粒 第27-28页

　　·表达载体及克隆载体图 第28-30页

　　·培养基 第30-33页

　　·主要仪器设备 第33页

　　·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的克隆 第33-39页

　　·番木瓜RNA提取 第33-34页

　　·试验器材的处理 第33-34页

　　·从组织中提取总RNA 第34页

　　·双链cDNA合成 第34-35页

　　·引物设计和RT-PCR反应 第35-36页

　　·PCR扩增程序 第36页

　　·PCR产物回收与鉴定 第36-39页

　　·PCR产物回收 第36-37页

　　·PCR回收产物与克隆载体pMD18-T Vector的连接 第37页

　　·大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) 第37-38页

　　·连接产物转化感受态细胞 第38页

　　·重组质粒的菌液PCR鉴定 第38页

　　·序列鉴定与分析 第38-39页

　　·酵母双杂交鉴定PRSV-VPg与番木瓜eIF4E和eIFiso4E的互作 第39-47页

　　·酵母诱饵表达载体pBD-GAL4 Cam-VPg的构建及鉴定 第39-41页

　　·VPg基因加入相应的酶切位点 第39页

　　·重组质粒的提取(采用TIANGEN小提中量试剂盒) 第39-40页

　　·重组质粒的酶切鉴定 第40页

　　·诱饵载体pBD-GAL4 Cam的制备 第40页

　　·VPg基因与诱饵载体pBD-GALA-Cam的连接 第40-41页

　　·连接产物的转化及鉴定 第41页

　　·酵母激活域表达载体pAD-GAL4-2.1-eIF4E/eIFiso4E的构建及鉴定 第41-42页

　　·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因加入相应的酶切位点 第41-42页

　　·重组质粒的提取 第42页

　　·重组质粒的酶切鉴定 第42页

　　·激活域载体pAD-GAL4-2.1的制备 第42页

　　·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因与激活域载体pAD-GAL4-Cam的连接 第42页

　　·连接产物的转化及鉴定 第42页

　　·诱饵质粒的转化及毒性与自激活检测 第42-44页

　　·酵母菌株表型鉴定及酵母感受态细胞的制备 第43页

　　·酵母菌株表型鉴定 第43页

　　·酵母感受态细胞的制备 第43页

　　·分别转化重组子pBD-GAL4 Cam-VPg和空载体pBD-GAL4 Cam(对照)入酵母YRG-2感受态 第43-44页

　　·诱饵表达质粒的毒性检测 第44页

　　·诱饵质粒表达的融合蛋白自激活检测 第44页

　　·激活域载体转化酵母YRG-2及毒性与自激活检测 第44-45页

　　·酵母感受态细胞的制备 第44-45页

　　·分别转化重组子pAD-GAL4-2.1-eIF4E/eIFiso4E、空载体pAD-GAL4-2.1(阴性对照)及pGAL4(阳性对照)入酵母YRG-2感受态 第45页

　　·激活域表达质粒的毒性检测 第45页

　　·激活域表达质粒自激活检测 第45页

　　·酵母双杂交 第45-46页

　　·含有诱饵质粒的酵母感受态细胞的制备 第45页

　　·转化激活域重组子入含有诱饵质粒的酵母感受态细胞 第45-46页

　　·酵母克隆的初步鉴定 第46-47页

　　·β-半乳糖苷酶影印法筛选阳性克隆 第46页

　　·阳性酵母质粒的提取、回转大肠杆菌验证 第46-47页

　　·阳性克隆的测序 第47页

　　·双分子荧光互补技术验证鉴定PRSV-VPg与番木瓜eIF4E和eIFiso4E的互作 第47-51页

　　·BiFc载体的构建 第47-50页

　　·添加酶切位点 第47-48页

　　·酶切反应体系 第48-49页

　　·BiFc表达载体的构建与鉴定 第49-50页

　　·重组质粒的大量提取(利用TIANGEN的高纯度大提试剂盒) 第50页

　　·基因枪转化 第50-51页

　　·金粉的处理 第50页

　　·基因枪的子弹制备 第50-51页

　　·轰击 第51页

　　·洋葱表皮预处理 第51页

　　·荧光显微镜下观察 第51页

　　3 结果与分析 第51-64页

　　·番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的克隆 第51-56页

　　·番木瓜果实总RNA的提取 第51-52页

　　·番木瓜eIF4E基因全长序列的克隆 第52-53页

　　·番木瓜eIFiso4E基因全长序列的克隆 第53页

　　·Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E结构分析 第53-56页

　　·酵母双杂交互作结果 第56-60页

　　·酵母表达载体的构建 第56-58页

　　·酶切位点引入PRSV-VPg、Cp-eIF4E及Cp-eIFiso4E 第56-57页

　　·诱饵载体和激活域载体的构建和鉴定 第57-58页

　　·酵母菌株YRG-2表型鉴定 第58页

　　·诱饵载体转化酵母YRG-2毒性及自激活检测 第58页

　　·激活域载体转化酵母YRG-2毒性及自激活检测 第58-59页

　　·酵母双杂交筛选结果 第59-60页

　　·营养缺陷型筛选及LacZ活性筛选 第59-60页

　　·回转验证及测序 第60页

　　·双分子荧光互补技术验证PRSV-VPg与Cp-EIF4E和Cp-eIFiso4E的互作结果 第60-64页

　　·BiFc载体的构建与鉴定 第60-62页

　　·基因枪转化结果 第62-64页

　　4 讨论 第64-67页

　　·Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E上与mRNA帽子及4G作用的活性部位氨基酸与其它eIF4E和eIFiso4E的高度保守 第64页

　　·已知抗病位点在Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E上的定位 第64-65页

　　·马铃薯Y病毒VPg利用植物eIF4E及eIFiso4E的情况 第65页

　　·GAL4酵母双杂交系统和BIFC同时研究PRSV-VPg与CP-eIF4E和CP-eIFiso4E的互作情况 第65-66页

　　·以番木瓜eIF4E为靶点抗PRSV的可行性 第66-67页

　　5 主要结论及进一步研究建议 第67页

　　·主要结论 第67页

　　·进一步研究建议 第67页

　　参考文献 第67-75页

　　附录 第75-76页

　　致谢 第76页

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