公卫执业医师考点：炭疽诊断标准及处理原则—附录A
炭疽细菌学检查
A1 标本的采取
A1.1 采取标本时必须遵循的两条原则
A1.1.1 尽可能在抗生素治疗开始前采取标本。
A1.1.2 除必要时并在具备操作病毒细菌条件的实验室内，不得用解剖的方式获取标本。所需的血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。
A1.2 血液标本
所有的疑似人类病例和病畜，都应采取血液标本，标本量至少应满足下列检查的需要：
a)涂片进行显微镜检查;
b)接种培养基进行细菌分离培养;
c)分离血清检查抗体;
d)常规血液检查。
A1.3 粪便与呕吐物标本
表现消化道症状的可疑病人收集粪便或呕吐物标本，特别注意选取其中混有血液的部分，置无菌容器中。
A1.4 痰与咳碟标本
表现为呼吸道症状的可疑病人应收集其痰液标本，无痰液者，应取供细菌分离培养用的培养基，打开平皿盖置病人口鼻10cm处;令病人对平皿咳嗽，然后迅速盖上平皿。
A1.5 脑脊液标本
表现脑膜刺激症状的病人，腰椎穿刺获取脑脊液，标本量参照A1.2的要求。
A1.6 尸体标本
食草动物死于炭疽时，通常会从口、鼻、肛门等腔道开口流出血液，这种血液应是首先采取的标本。如果血液已渗入土壤，则应收集混有血液的土壤作为标本。没有血液流出，或已不可能获取血液标本时，可通过穿刺心脏获得血液或穿刺肝脏等实质性脏器获得组织标本。
A1.7 肉类标本
如果怀疑罹患炭疽的家畜已被宰杀，或对商品肉类进行常规检查时，可剪取小块肉类标本。如有可能，特别应剪取肝脏、脾脏等富含血液以及含淋巴组织的标本。
A1.8 毛皮或其他可疑污染物品标本
剪取小块毛皮或其他可疑物品，剪碎置无菌试管内，加适量无菌生理盐水浸泡。
A1.9 水标本
检查水体污染时，用广口瓶收集水样。如须取深层水样时，将带盖广口瓶伸入水中，然后将用绳系住的瓶盖提起。
A1.10 土壤标本
在牲畜死亡或宰杀的地点，应取土壤标本以供检查。
A2 显微镜检查
所有来自病人、病畜或尸体的标本，都应首先进行显微镜检查。
A2.1 复合负染法
将标本或悬液滴在载玻片上，立即加等量的炭素墨水，混匀推片。待干燥后滴加95%乙醇数滴，干燥后再以1%结晶紫液染1min，用水冲洗，干后用油镜检查。如果发现在细菌与炭素颗粒之间存在明显的、连续的间隔带，即说明细菌的周围存在荚膜。
液体标本(如血液、脑脊液)和悬液标本(如粪便或混有血液的土壤)在能够采取标本后立即进行显微镜检查的情况下，推荐使用复合负染法。
A2.2 荚膜染色法
将标本涂片或印片干燥，妥善包装后带回实验室，按常规方法固定，以美蓝染液染色3～5min(如荚膜不清晰，染色时间可稍延长)，水洗、干后镜检。菌体呈蓝色，而荚膜呈红色。
组织印片标本，或制片后无法立即进行显微镜检查，或进行大面积普查时，推荐使用荚膜染色法。
A2.3 显微镜检查结果判定
来自病人、病畜或尸体的标本中如发现由较宽的荚膜环绕的、两端平齐的粗大杆菌，特别是镜下发现大量、纯一通常呈竹节状的该种细菌，而且没有明显的其他细菌污染时，炭疽的诊断便可确立。
A3 细菌分离培养
A1 中所列的全部标本，均应进行细菌分离培养。
A3.1 培养基
炭疽芽孢杆菌的分离培养应同时用两种培养基进行：常规的血琼脂平板和选择性平板。后者按如下处方配制：
蛋白胨 2g EDTA 0.03g
氯化钠 0.5g 乙酸亚铊 0.004g
醇母浸膏粉 0.5g 水杨素 1g
0.2%溴麝香草酚蓝(BTB) 1.2mL 琼脂粉 1.8g
加蒸馏水至100mL，调pH至7.6，121℃灭菌20min，冷却至45～50℃时，加入：多粘菌素B(3000u/mL水溶液)0.1mL，溶菌酶(30000u/mL水溶液)0.1mL，混匀后倾注平板。
A3.2 标本处理
在正常情况下应当无菌的标本，如血液或脑脊液，直接涂布上述两种平板，每平板0.1mL，组织标本应先以无菌剪刀剪开一断面，在培养基表面压印，然后以白金耳涂开。
所有污染的和陈旧的标本，均应首先制成悬液。根据标本中含菌量的多少，可将悬液适当稀释，或经自然沉淀除去粗大沉淀物后，再3000r/min离心30min，取富集的沉淀物。将所得的悬液67℃加热15min，冷却后涂布上述两种平板，每平板0.1mL。
A3.3 挑选可疑菌落
上述平板在37℃孵育过夜或24h后，检查是否长出可疑的炭疽芽孢杆菌菌落。
炭疽芽孢杆菌在血琼脂平板上的形态为：灰白色、不透明、中等大小，常不规则，表面呈毛玻璃样，周围无溶血环。
炭疽芽孢杆菌在选择平板上菌落较血琼脂平板上为小，具有类似表面特征，菌落呈蓝绿色。但是，若遇菌落形态与以上描述完全一致但呈黄色的菌落，也应进行A4的鉴定步骤。
A4 炭疽芽孢杆菌鉴定
将上述可疑菌落挑出，划线接种于普通营养琼脂平板之上，在划线区内分别贴上浸有诊断用炭疽芽孢杆菌噬菌体和青霉素的纸片。37C孵育过夜或24h后，在两种纸片的周围均出现明显的抑菌环，便可判定为炭疽芽孢杆菌。在病人、病畜或尸体中分离获得炭疽芽孢杆菌，炭疽的诊断便可确立。
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