影响免疫检测的因素有哪些

时间：2022-10-25 15:56:28 少烁检验技师/士我要投稿

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影响免疫检测的因素有哪些

　　影响免疫检测的因素有很多，包括缓冲液、封闭、抗体、清洗、检测底物等等。下面是yjbys小编为大家带来的影响免疫检测的因素的知识，欢迎阅读。

　　影响免疫检测的因素有哪些 1

　　缓冲液

　　最常用的两种缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris缓冲液(TBS)。调整配方中缓冲液组分的各种改良配方已见诸期刊。缓冲液的关键要求是它应有助于保持抗体的生物活性。因此，离子强度和pH值应相当接近生理状态。PBS的配方(磷酸盐总浓度10mM)适用于广泛的抗体和检测底物。

　　在孵育过程中，装有膜的容器应轻轻摇动。缓冲液的量应足够，完全覆盖膜，使其在缓冲液中自由漂浮。如果不止一张印迹放在容器中，缓冲液容量不足会导致印迹膜粘在一起。这将影响孵育溶液的充分接触，导致各种假象，如背景高、信号弱和灵敏度不均匀等。

　　封闭

　　要获得有意义的结果，必须保证抗体只与感兴趣的蛋白质结合，而不与膜结合。利用惰性蛋白、非离子去污剂，或无蛋白的封闭剂来封闭膜上未被占据的位点，可减少抗体的非特异结合(NSB)。

　　封闭剂与膜的亲和力应高于抗体。它应填满膜上未被占据的位点，但不会替换膜上的目标蛋白。最常用的封闭剂是牛血清白蛋白(BSA，0.2-5.0%)、脱脂牛奶、酪蛋白、明胶、吐温20去污剂的稀释液(0.05-0.1%)以及Blk试剂。封闭剂通常溶解在PBS或TBS中。

　　与封闭相关的风险包括：选择不适当的封闭剂或过量封闭会替换或掩盖目标蛋白质。因此，封闭剂的正确选择对成功的免疫检测很关键。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白标记的抗体，因为牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特异性抗体对磷酸化蛋白进行检测分析时，如果采用粗蛋白制剂作为封闭剂，由于这些制剂中可能含有磷酸酶，而印迹上的磷酸化蛋白会被这些酶去磷酸化，就有可能会影响分析结果。研究表明，在封闭液中添加磷酸酶抑制剂可增强磷酸化特异性抗体的信号。此外，适用于一种抗原-抗体组合的封闭剂可能不适用于其他组合。

　　封闭液被点样在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸润，并在TBS中平衡。随后在印迹上添加检测试剂，孵育5分钟，并曝光在X射线胶片上。暗斑的出现则表明封闭剂与检测试剂不兼容。如果在标准的Western印迹操作中用Immobilon-P转印膜来替代Immobilon-PSQ转印膜，那么封闭液可能不足以饱和膜表面。可能需要更多的清洗步骤来降低背景。

　　抗体

　　在封闭之后，印迹与一个或多个抗体孵育。第一个抗体与目标蛋白结合，而第二个抗体与第一个结合。第二个抗体结合有酶或染料，可用来指示蛋白的位置。

　　尽管一抗能直接标记，但使用二抗有明显的优势。首先，不止一个二抗分子能够与单个一抗分子结合，形成信号扩增。其次，标记的二抗(酶-抗体结合物)可用于大量不同特异性的.一抗，从而不再需要标记多个一抗。

　　多克隆或单克隆的一抗都可使用。多克隆抗体通常是以抗血清或亲和纯化的抗体形式提供的。单克隆抗体是在腹水或组织培养液中表达的，可直接使用或进行亲和纯化。一定要记住，变性蛋白可能无法被天然抗原培育出的抗体所识别。在某些情况下，可能需要非变性凝胶来进行印迹。抗体以缓冲液和封闭液稀释，以避免与膜的非特异结合。抗体稀释液通常也包含痕量的吐温20或另一种去污剂，以防止抗体的非特异聚集。许多发表的化学发光操作需要在封闭液和抗体稀释液中添加0.1%(v/v)吐温20。我们必须认识到，高于0.05%(v/v)的浓度有可能从膜上洗掉一些印迹的蛋白质。

　　提高吐温20去污剂的浓度通常会降低背景。一种更简单且更经济的策略是降低抗体的浓度，特别是二抗(详见图1)。抗体必须特异针对目的蛋白，不能与封闭液中的组分交叉反应，且应该是相对纯净的。其他蛋白质或聚集物形式的杂质会导致非特异性结合和背景增高。

　　免疫检测是一种极其灵敏的方法。为了实现高的信噪比和最高的灵敏度，一抗和二抗的浓度应针对每种情况来优化。一般来说，高倍稀释一抗或降低凝胶上的蛋白上样量可减少非特异信号。高倍稀释酶标记的二抗可最大限度降低整体的高背景。

　　一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。高灵敏度的试剂(检测到飞克级)与低灵敏度的试剂(检测到皮克级)相比，抗体用量可减少20倍。抗体浓度的优化取决于检测底物的例子如图13所示。在使用最灵敏的检测试剂时，过量的抗体导致高的非特异性和整体背景增高(左上)。在这种情况下，将一抗稀释度从1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用没那么灵敏的检测试剂(中间和最下面一行)时，抗体需要更为浓缩，以产生相同的信号。

　　清洗

　　清洗印迹，从膜上去除未结合的抗体，它们可能导致高背景和检测不佳。通常使用吐温20的PBS或TBS稀释液(0.05% v/v)，特别是当抗体制剂是粗制的，或高浓度使用时。如前所述，浓缩的去污剂溶液可能导致感兴趣的蛋白质从膜上洗脱。对于高度纯化的抗体，往往只使用缓冲液进行清洗。

　　所需的清洗次数最好根据实验来确定。清洗太少会产生过多的背景，而清洗过度有可能洗脱抗体并降低信号。建议至少清洗三次，每次5分钟。

　　在TBS清洗液中添加最多0.5M NaCl和0.2% SDS，并将清洗时间延长至2小时，可降低顽固的背景。

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　　影响检验结果的因素

　　1、试剂和设备。

　　一般来说，在免疫检验的实际操作过程中，检测人员首先应选择合适的检测设备和试剂，否则会对最终的检测结果产生一定影响。其次，要求检验人员熟悉质量控制，比如，要提前对相关实验仪器进行校准，严格控制试剂质量，保证试剂的良好性能等。否则可能会导致测试结果中出现大量偏差，影响免疫分析结果的准确性。

　　2、样本因数。在样品采集、运输和储存等众多环节中，存在影响免疫测定质量的潜在因素。其中，标本采集是最基本的因素之一。采集血样时，采集时间不合理或采集姿势不规范，检测结果将受到影响；在样品运输过程中，操作失误会破坏样品的有效性，大大降低了检验质量。另外，当存储样品时，过高或过低的温度都会使样品无效，使得测试结果的质量难以保证。在样品检测过程中，如果检测器不能有效地处理样品的干扰因素，不仅不利于免疫分析的顺利进行，而且使检测结果的准确性无法保证。

　　3、检查人员因素。作为免疫检测分析的执行者，免疫分析显得尤为重要。专业技能和综合素质水平，以及技术的熟练程度，与免疫测试结果都密切相关。

　　保证检验准确的措施

　　1、加强设备的维护和管理，严格保证试剂质量，已成为免疫分析的重要组成部分。在实际的免疫测定过程中，使用的设备和试剂必须是已得到主管部门的批准，并获得相应的.生产许可证的。检验人员应根据相关条件的要求储存试剂，对免疫分析仪器和设备进行日常维护和管理，定期检查和纠正其准确性，保证检测仪器的一致性。如果检查员发现仪器有偏差，应立即调整。目前中国市场上有许多免疫分析试剂存在一定差异，在选择试剂时，检验人员应仔细选择，确保其性能和质量符合检验要求，以避免后续检验中不合格试剂造成的误差。在特殊情况下如果根据需要更换试剂，检查员还应进行比较试验。在储存阶段，要勤检查试剂是否在有效期内，另外要为试剂提供合适的环境，防止试剂失效影响检测结果。

　　2、合理选择试验方法和正常上限。当测试用于相同目的时，通常有多种可选择的测定方法，但是，并非所有的测试方法都符合实际要求。因此，在比较试验的基础上，检测者需要选择更可行的免疫分析方法，以确保测试结果能真实反映患者实际状况。

　　3、在采集血样前，需提前告知受测者相关注意事项，如采集血样前12小时内要保持良好的饮食习惯和休息模式；采集空腹血样不能吃早餐等。采集血样时，指导受测者保持正确的姿势。采集过程中，选择高品质的稳定剂或抗凝剂。对于用于药物检测的血液样本，收集时间和地点的变化将直接影响检测结果的质量，因此应特别注意采血过程。

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