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微生物检验常见问题解答
微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，与人类关系密切。以下是小编为大家收集的微生物检验常见问题解答，仅供参考，欢迎大家阅读。
一、方法验证
1.做过验证的样品微生物检验方法是否都需要按照新的方法进行重新验证？
答：对于微生物限度检查的产品而言，由于培养时间调整，应重新进行验证。对于无菌检查的产品而言，如果方法未作实质性调整，可以不必重新验证。个别产品在各论中收载了新的无菌检查方法，对这些品种，应对收载方法的适用性进行验证。
2.以前做过无菌验证的品种是否需要重新按照新的标准再验证？
答：参见问题1。
3.“新增抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜”比如注射用克林霉素磷酸酯属于抗生素，是否需要重新选取滤膜再验证？
答：目前采用的方法如果经验证表明可行，则可以继续使用该方法。
4.微生物方法学验证时，培养时间是否跟样品日常检验所培养时间一致？
答：应该一致。
5.微生物限度验证时，如果一个方法只有金葡回收率达不到要求，该方法时是否可以用来做细菌霉菌的检测方法？
答：按药典的规定，一个计数方法通过验证，是指所有试验菌的回收率均达到要求。如果采用各种方法以及方法的组合仍无法使金葡回收率达标，则可以采用使金葡回收率最高的方法作为计数方法。
6.薄膜过滤的冲洗量不能超过1000ml，我公司的喹诺酮类产品原来的方法是每张膜冲洗量为1500和2000ml，请问有没有合适的方法将冲洗量降至1000，各菌的回收率仍能符合规定？
答：有几种办法可以降低冲洗剂的用量：
1)降低接触滤膜的供试品的浓度;
2)改进冲洗的方式，如少量多次地冲洗、降低蠕动泵的转速等;
3)添加中和剂，如高价金属离子。
7.微生物限度检查法规定，技术方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品检验。请问，上述方法是指仅通过一种方法还是一定要通过几种方法联用的？
答：应该要把可能采用的所有方法包括方法联用都进行验证。
8.供试品不溶于稀释剂，同时又有抑菌性，限度检查时应如何消除抑菌性？
答：采用低速离心的方式，尽可能把供试品去除干净，取离心后的上层液，进行薄膜过滤。
9.不溶于水的固体产品，加表面活性剂后，如何操作才能在方法验证中得到较好的回收率？
答：同问题8。
10.有些品种2010年药典与2005年比较检验方法变了，是否需要验证或确认？
答：同问题1。
二、菌种管理
1.浓菌液的有效期该如何确定？
答：药典没有规定。可以通过实验确定有效期。例如，在不同的时间点测定浓菌液的浓度，从而判断其有效期。
2.药典要求菌液在制备后2小时内使用，若保存在2-8℃的菌悬液可在在24小时内使用，那我们在做验证或阳性对照是要加一定量的菌就没有时间进行平板计数了，该如何确保所加菌量准确？
答：药典对稀释菌液的使用期限作出规定，并不会影响操作过程中稀释菌液的加入。即便不规定，也无法在准确知道菌液浓度的情况下加入试验菌。菌液稀释的实验操作和加入菌液的实验操作应该是在同一次实验中完成的，要使加入的菌量符合药典的规定，可以从浓菌液的制备方法、菌液稀释的方法等方面进行规范，也可以引入浊度比较的方法。
3.菌悬液能否在倒平板之前确定菌含量？
答：活菌含量是无法确定的。总菌量可以通过比浊的方式确定。
4.具体从哪些方面进行菌种菌株的特性和纯度确认？如何操作？
答：基层的微生物实验室进行菌种纯度确认可以考虑以下一些方面：1)形态学鉴定，包括菌落形态和染色形态;2)生化鉴定，可以考虑使用API鉴定系统。
5.黑曲霉冻干菌种如何转种，传代？
答：与其他菌种一样，所不同的是使用的培养基应改为改良马丁琼脂培养基。
6.干粉状的是否可做第0代使用？
答：只要是菌种保藏机构提供的冻干保藏的菌种，可以确定为第0代。
7.菌种每次传代都要做纯度、特性等的确认吗？
答：从外部购入的菌种，在进入本实验室的菌种保藏体系时，需要进行纯度和特性的确认。以后的每次传代，可以通过显色培养基做简单的确认即可。
8.如采用低温保存菌种，需购买哪些设备？能够到省所进行实际操作培训？
答：低温冰箱，应能够提供-70℃的低温。可以到省所来培训。
9.做方法验证时，工作用菌种能否同时操作，如何防止交叉污染？
答：可以同时操作。避免交叉污染的关键是无菌操作技术。
10.是否等菌悬液的含菌数出结果后再做适用性等检查？
答：没有必要。可参见问题2。
11.菌液制备中菌液是否都要验证储存期？
答：稀释菌液可参考药典规定。如要保存浓菌液，则需要验证有效期。
12.菌种CMCC是否可以用ATCC替代，从省所或中检所购买的菌种是否每次都可以出具规范的COA？
答：中国药典使用CMCC的菌种，并没有规定可以使用其他等效的菌种。省所提供的菌种严格讲属于标准贮备菌种，无法提供ATCC这样的COA。CMCC至今也无法提供这类证明。
13.铜绿假单胞如何保藏？答：可以使用低温冷冻保存的方法。
14.工作用菌液是否属于亚培养或传代一次？
答：工作用菌液应属于一次传代。
三、微生物限度
1.包装材料的大肠埃希菌检查？
答：根据包装材料的不同，大肠埃希菌的检查方法大致有两种，一种是将浸提液合并后，取一部分，接种胆盐乳糖培养基进行检查;另一种是将浸提液合并后，薄膜过滤，然后按规定的方法检验。
2.抗真菌药品的微生物限度检查法
答：这类产品的霉菌和酵母菌计数方法需要进行调整，可以根据产品剂型的不同，选择薄膜过滤法或培养基稀释法等方法。
3.为什么在日常样品检测中还需要做阳性对照(国外不需要)？
答：为了确保每一次检测对可能存在的微生物都是有效的。
4.对于同一个品种，药典为什么不规定统一的检测方法？
答：本版药典进行过这样的尝试，也有某些品种已经收载了统一的检测方法，如注射用头孢类抗生素的无菌检查。之所以没有大量收载，主要是由于检测方法还没有经过必要的复核。将微生物检验的统一方法收载在品种的各论项下，始终是努力的方向。
5.梭菌检查中需置厌氧条件下培养48小时，是否指在厌氧培养箱中？
答：需要在厌氧培养装置中进行培养，未必一定是厌氧培养箱。
6.控制菌检查方法验证时，采用多种方法均未检出控制菌，如何处理？
答：在确保所使用的各种方法都没有错误的情况下，如果仍无法使试验菌生长，则应该采用薄膜过滤法进行检查。理由是该方法能够最大程度地去除产品的抑菌作用。
7.常规的监督抽样检品(包括原料)在进行微生物限度检查时，是否一定要进行活螨检查并在原始记录与报告书中体现？
答：需要进行检查。可以在原始记录中体现，报告书上可以不出现，除非当发现有活螨检出。
8.药包材微生物限度检查规定了合格质量水平，通常产量下取样8个，要求8个瓶子均符合规定，如何进行？
答：每个瓶子分别进行实验。
9.大肠埃希菌具体操作规程？
答：参见中国药品检验标准操作规程。
10.动物组织及动物类原药材的提取物入药，是否需要检沙门菌？
答：需要进行沙门菌检查。
11.关于中国药典菌落计数结果的判断还存在疑义，望能举例说明。
答：不清楚所指的存在疑义是指哪方面。2010年版对结果报告进行了较大篇幅的修订，目前的规定应该比05版更为清晰、明确。
12.需做沙门菌检验样品量的确定？
答：10g(ml)用于样品计数检验和其他控制菌检查，10g(ml)用于沙门菌检查，10g(ml)用于沙门菌检查的阳性对照。需要进行沙门菌检查的样品，检验用量应为30g(ml)。
13.日常的实验室装备能否达到梭菌无氧的培养要求？
答：完全可以。可以采用厌氧培养盒(罐)。
14.如果一个产品有两个规格，是否可以取其中之一做阳性对照？
答：每个规格均需进行阳性对照。
15.细菌数为100g/g的，样品稀释级只做1:10,1:100的倍数就可以了吗？
答：可以。
16.培养时间3天，5天，可理解为72小时，120小时吗？
答：可以。这样更为严谨。
17.中国药品检验标准操作规范“已做验证试验的供试品，在检查时刻不必再做阳性对照”如何理解？
答：该标准操作规范中在无菌检查法中规定“供试品无菌检查应进行阳性对照试验”，表明不论是否进行了方法验证，在产品的每一次检验过程中，还必须进行阳性对照。在控制菌检查的大肠埃希菌项下，指出“已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再作阳性对照”。该规定仅适用方法验证与供试品检查同时开展的情况。2005年版药典和2010年版药典在控制菌检查中均对阳性对照试验有明确规定，“进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。”产品检验中应以药典规定为准。
18.无菌检查和微生物限度检查中，产品中规定的溶解液是否可以换成其他的溶液？
答：可以。
19.制剂通则中，没有微生物检查项目的，是否可不进行微生物项目检测？
答：可以。主要是二部制剂通则中口服片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。
20.在细菌、霉菌和酵母菌计数中，适用性检查细菌是培养48小时，霉菌和酵母菌是培养72小时，供试品检查中细菌是培养3天，霉菌和酵母菌是培养5天，那方法验证中应参照哪个时间进行培养。
答：应按照供试品检验时的条件，即细菌3天，霉菌和酵母菌5天。
21.测定纯化水微生物限度时，每张滤膜过滤量是多少合适？需要先稀释吗？过滤完后需不需要冲洗？假如我取10ml纯化水通过双杯体封闭式薄膜过滤器过滤，每张滤膜上的计数是以5ml为单位还是10ml为单位？
答：过滤量应以培养后出现的微生物数不超过100cfu/膜为标准。一般可不稀释。不需要冲洗。每张滤膜的过滤量为5ml。
22.2010药典中关于纯化水的微生物限度是：细菌、霉菌及酵母菌总数每1ml不得过100个。这句话的意思是细菌总数每1ml不得过100个，霉菌及酵母菌总数不得过100个，还是细菌+霉菌+酵母菌总数每1ml不得过100个。如果是三者总数的话，那细菌总数限度是多少？霉菌及酵母菌总数限度又是多少？
答：是总数不得过100个。没有必要考虑各自的限度值。
拓展阅读：微生物检验的名词解释大全
微生物：是一群个体微小 结构简单 肉眼不能看见的微小生物的总称
种：亲缘关系较近的微生物群体 在进化发育阶段上有一定的共同形态和生理特征
微生物学：生物学的一个分支 是研究微生物在一定条件下的形态结构 生理生化遗传变异特性及微生物的进化 分类 生态等生命活动规律以及微生物之间 与人类 动植物 自然界互相关系的一门科学
抗生素：是由某些微生物在代谢过程中产生的 能抑制或杀灭某些其他微生物和肿瘤细胞的微量生物活性物质
细菌素：是某些细菌菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质
条件致病菌：正常菌群在宿主体内具有相对稳定性 一般不致病
消毒：指杀死物体上的病原微生物但不一定能杀死细菌芽孢的方法
灭菌：指杀灭物体上所有的微生物的方法
防腐：指防止或抑制微生物生长繁殖的方法
无菌：指没有货的微生物的存在
质粒：是细菌染色体外的遗传物质 也是环状闭合的双联DNA分子 比染色体小 存在于细胞质中 可自主复制
突变：是指细菌遗传物质的机构发生突然而稳定的改变 所致的变异现象可遗传给后代 基因转移：外源性物质由供体菌转入受体细胞内的过程
基因重组：供体菌的基因进入受体菌细胞 并在其中自行复制与表达 或矛受体菌DNA整合在一起的过程
病毒：是一类个体微小 结构简单 只含一种核酸 只能在活的易感细胞内以复制方式增殖的非细胞型微生物
复制周期：病毒的增殖被人为分成吸附 穿入 脱壳 生物合成 装配 成熟与释放七个步骤的完整过程
缺陷病毒：是指因病毒基因组不完整或因基因某一点改变而不能进行正常增殖的病毒 顿挫感染：病毒进入宿主细胞 若细胞缺乏病毒复制所需的酶 能量和必要成分等 则病毒无法合成自身成分不能够装配和释放子代病毒的现象
干扰现象：两种病毒感染同一种细胞时 可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象 人工自动免疫：是将疫苗等免疫原接种于人体 刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答 使机体获得特异性免疫力
人工被动免疫：是指注射含某种病毒特异性中和抗体的免疫血清等一系列细胞因子 是机体立即获得特异性免疫
干扰素：是由病毒或干扰素诱生剂作用于中性粒细胞 成纤维细胞或免疫细胞产生的一种糖蛋白
致病性：一定种类的病原微生物 在一定的条件下能在特殊的宿主体内引起特定疾病的能力 半数致死量：在规定时间内 通过一定途径 能使一定体重或年龄的某种动物半数死亡或感染需要的最小病原体数量或毒素量
急性感染：发作突然 病程较短 一般是数天或数周
局部感染：病原体侵入机体后 局限就在一定部位生长繁殖引起病变的一种感染类型 毒血症：致病菌侵入宿主体后 只在机体局部生长繁殖 病菌不进入血液循环 但其产生的外毒素入血 引起特殊的毒性症状
败血症：致病菌侵入血流后 在其中大量繁殖并产生毒性产物 引起全身性毒性症状
内毒素血症：革兰阴性菌侵入血流 并在其中大量繁殖 崩解后释放出大量毒素 也可有病灶内大量革兰阴性菌死亡 释放的内毒素入血所致
培养基：是指人工方法配制的适合细菌生长繁殖的营养基质
CFU：菌落形成单位
细胞病变效应（CPE）：是指某些病毒感染组织细胞后 正常生长的梭形细胞变圆 变性 坏死 溶解及从培养瓶壁脱落 细胞堆积形成葡萄状
包涵体：某些病毒感染细胞后 可在细胞核或细胞质中形成包涵体
医院感染：是指住院患者在医院内获得的感染 包括在住院期间发生的感染和在医院内获得出院后发生的感染 但不包括在入院前已开始或住院时已存在的感染
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